Embriyonik Meckel Kıkırdak içinde Zebrabow klonal Hücre Analizi aracılığıyla Kondrosit interkalasyonu ve Yön Yayılması Görselleştirme
Summary
Kraniyofasiyal kemiklerin Hücre organizasyonu uzun öne sürülmüştür ancak doğrudan görüntülenmiştir olmamıştı. Çok spektral hücre etiketleme ve in vivo canlı olarak Görüntüleme Zebra balığı alt çene dinamik hücre davranışı görselleştirme sağlar. Burada, biz detay protokolü Zebrabow transgenik balık işlemek için doğrudan hücre ardalanması ve Meckel kıkırdak kondrosit morfolojik değişiklikleri gözlemek.
Abstract
Omurgalı kraniofasial yapıların geliştirilmesi hücre göçü, çoğalması, yapışma ve farklılaşma hassas koordinasyon gerektirir. Meckel kıkırdağı, birinci farengeal kemer türevinin, bir Desenlendirme kranial nöral krest (CNC) hücrelerin göçünü ve ilerici bölümleme, çoğalmasını ve farklılaştırılmış kondrositlerin organizasyonunu gerektirir. Çeşitli çalışmalar alt çene morfolojilerinden sırasında CNC göç tarif, ama kondrositler Meckel kıkırdak büyümesi ve uzantısı organizasyonu gerçekleştirmek nasıl ayrıntıları belirsizliğini korumaktadır. Sox10 kısıtlı ve kimyasal olarak neden olunan Cre rekombinaz aracılı rekombinasyon ve böylece ayrı bir klonal popülasyonları yansıtan progenitör hücrelerin ve bunların soyu bir multi-spektral etiketleme oluşturma farklı floresan protein (RFP, YFP ve CFP) PERMÜTASYON oluşturur. Konfokal zaman atlamalı fotoğraf kullanarak, kıkırdak gözlemlemek mümkündür Behaviya Zebra balığı Meckel kıkırdak gelişimi sırasında.
Çok bantlı cep etiketleme Meckel kondrosit uzantısı göstermek için bilim adamları sağlar. Çene prefigures Meckel kıkırdağı, uzatma aşamasında, kondrositlere onlar organize bir tek hücreli katmanlı satırda yığını olarak uzantısı etkileyecek enterkale. Hücre uzantısı aracılık etmek, bu örgütlü interkalasyon sürecinin başarısızlığı biz çene malformasyonlar gözlemlediğimiz hipoplastik mandibula için hücresel mekanistik açıklama sağlar.
Introduction
Kraniyofasiyal gelişme hücre çoğalması, göç ve farklılaşma 1,2, 3 sürücü karmaşık moleküler, hücresel ve doku etkileşimleri gerektirir. Bu sıkı regüle ve karmaşık bir süreç kraniofasial deformiteler en yaygın doğum anomalileri 1-9 arasında olacak şekilde genetik ve çevresel pertürbasyonlar tabidir. Cerrahi girişimler geliştirme temelini anlamak, kraniofasyal anomaliler için tedavinin temelini kalırken gelecek tedaviler yenilik şarttır. Bu nedenle, yakınsama ve uzatma ve hücre entegrasyonu morfolojilerinden ve mekanizmaları okuyan kraniofasyal iskeletin 1 oluşumuna yepyeni bakış açıları sağlar.
Kranial nöral krest geçirmek ve birinci faringeal kemer çene prefigures Meckel kıkırdağı, oluşturmak için uzatmak, daha sonra eşleştirilmiş formu mandibular süreçler doldurmak. Morphogenesis oMeckel kıkırdağı f yönlü çoğalması, hücre kutuplaşma ve farklılaşma 1,10 üzerinden kondrosit organizasyon gerektirmektedir. Ancak, Meckel kıkırdak büyümesi ve uzantısı kondrosit örgütünün karışıklık belirsizliğini koruyor. Dinamik hücre davranışını anlamak gibi hipoplastik mandibula fenotipleri 11 olarak çene boyutu, etkileyen konjenital anomali anlamak için çok önemlidir.
Zebra balığı embriyolar Meckel kıkırdağı morfolojilerinden ayrıntılı çalışma için birçok gelişimsel ve genetik avantajlar sunuyoruz. Onların genetik tractability, şeffaflık, ex vivo ve hızlı bir gelişme canlı görüntüleme 6 hücre hareketi ve organizasyon gözlem için iyi kredi güçlü avantajları vardır. Böyle sox10 olarak soy-tracing araçları kullanarak: kaede transgenik çizgi, biz ve diğerleri embriyonik kraniofasyal iskeletin 1,5 nöral krest kökenlerini tasvir var. Usiubi ile ERT2-Cre: sox10 ng Zebrabow-M transgenik hat, bu Kraniofasiyal gelişimi sırasında hücresel hareketlerin ayrıntılarını keşfetmek için artık mümkün. Zebrabow-M, farklı flüoroforlar ifadesini süren ubikuitin promotörü, Lox sitelerinin 8 tarafından sınırlanan her biri ile tasarlanmış bir transgenik bir çizgidir. Zebrabow-M varsayılan fluorofor RFP ifade Kırmızı. Cre ifade indüksiyon sonrasında Zebrabow-M birleşir inşa ve hücreler embriyo çoklu spektral ifade oluşturarak farklı fluorophores (RFP, OBP ve YFP) birleşimini ifade eder. Farklı yan yana atalarıdır kaynaklandığını hücre popülasyonları klonal etiketli böylece rekombinasyon olaydan sonra etiketli hücrelerden bölmek Tüm kızı hücreleri daha sonra klonal, etiketli. Bu klonlama hücre etiketleme ile klonal çözünürlüğe sahip hücre proliferasyon ve migrasyon (Şekil 1 ve 2) takip edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıdaki birbirini tamamlar açıklandığı gibi alcian mavi ve photoconvertible transgenik hatları kıkırdak ve kemik gelişimi karmaşık sürecini tanımlamak için kullanılır. Ancak, organogenezis sırasında canlı hücre göç ve organizasyon uzun hipotez ve dolaylı olarak gösterdi ama görüntülenmiştir asla edilmiştir. Bir kıkırdak Belirli Cre ile birleştiğinde Zebrabow-M transgen doğru, kemik ve kıkırdak oluşumunda yer, tüm bu olayların eş zamanlı canlı gözlem izin verir. Bu teknik mi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar nazik balık imkan ve çizgilerin mükemmel bakım için Zebrabow-M transgenik çizgi, pDEST vektör için Geoffrey Burns ve Renee Ethier-Daigle paylaştığınız için Alex Schier teşekkür ederiz.
FİNANSMAN:
Biz Çocuklar için Shriners Hastaneleri Çocukları (ECL) ve post-doktora eğitimi bursları için NIDCR RO3DE024490 ve Shriners Hastaneleri cömert fonlama desteği (LR ve YK) için minnettarız.
Materials
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μL stock aliquots at 50mg/mL |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Equipments | |||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
References
- Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140, 76-81 (2013).
- Dougherty, M., et al. Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model. The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).
- McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research. Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).
- Mossey, P. Dental education and CPD: are you being served. British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Vieira, A. R. . Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).
- Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development. PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).
- Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence. Teratology. 65, 116-120 (2002).
- Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, 3254-3265 (2013).
