Visualizzazione di condrociti intercalazione e direzionale proliferazione via Zebrabow Analisi cellulare clonale nella cartilagine del Embryonic Meckel
Summary
Organizzazione delle cellule di ossa cranio-facciali è stato a lungo ipotizzato ma mai visualizzato direttamente. Marcatura delle cellule Multi-spettrale e in vivo vivo l'imaging consente di visualizzare il comportamento delle cellule dinamica mandibola zebrafish. Qui, abbiamo dettaglio il protocollo di manipolare Zebrabow pesci transgenici e osservare direttamente intercalazione cellulare e cambiamenti morfologici di condrociti nella cartilagine di Meckel.
Abstract
Sviluppo delle strutture cranio-facciali vertebrati richiede coordinazione precisa di migrazione cellulare, la proliferazione, l'adesione e la differenziazione. Patterning della cartilagine del Meckel, un primo arco faringeo derivata, prevede la migrazione di cranico cresta neurale (CNC), le cellule e il partizionamento progressivo, la proliferazione e l'organizzazione dei condrociti differenziati. Diversi studi hanno descritto la migrazione CNC durante inferiore morfogenesi mascella, ma i dettagli di come i condrociti raggiungono organizzazione nella crescita e l'estensione della cartilagine di Meckel rimane poco chiaro. Il SOX10 limitata e indotto chimicamente Cre ricombinasi mediata ricombinazione genera permutazioni di proteine fluorescenti distinti (RFP, YFP e CFP), creando così un sistema di etichettatura multispettrale delle cellule progenitrici e la loro progenie, riflettendo popolazioni clonali distinte. Utilizzando confocale fotografia time-lapse, è possibile osservare i condrociti behavio durante lo sviluppo della cartilagine del pesce zebra di Meckel.
Etichettatura cella multispettrali consente agli scienziati di dimostrare l'estensione dei condrociti della Meckel. Durante la fase di estensione della cartilagine del Meckel, che prefigura la mandibola, condrociti intercalare di effettuare estensione come impilano in una cella singola fila stratificato organizzata. Fallimento di questo processo intercalante organizzato mediare estensione cella fornisce la spiegazione meccanicistica cellulare per mandibola ipoplasia che osserviamo in malformazioni mandibolari.
Introduction
Sviluppo craniofacciale richiede, interazioni cellulari e tissutali complessi molecolari di guidare la proliferazione cellulare, la migrazione e la differenziazione 1,2, 3. Questo processo strettamente regolato e complesso è soggetto alle perturbazioni genetici e ambientali, in modo tale che deformità cranio facciali sono tra le malformazioni congenite più comuni 1-9. Mentre gli interventi chirurgici rimangono il cardine del trattamento per le anomalie cranio-facciali, la comprensione della base di sviluppo è essenziale per innovare terapie future. Pertanto, lo studio della morfogenesi e meccanismi nella convergenza ed estensione e integrazione cella fornisce nuove intuizioni nella formazione dello scheletro craniofacciale 1.
Cranica migrazione cresta neurale e popolano il primo arco faringeo, poi formare coppie di processi mandibolare che si estendono a formare cartilagine di Meckel, che prefigura la mandibola. Morfogenesi of cartilagine di Meckel richiede organizzazione condrociti via proliferazione direzionale, la polarizzazione cellulare e la differenziazione 1,10. Tuttavia, la complessità di organizzazione condrociti nella crescita e l'estensione della cartilagine del Meckel rimane poco chiaro. Capire il comportamento delle cellule dinamico è fondamentale per comprendere malformazioni congenite che colpiscono le dimensioni della mandibola, come ad esempio ipoplasia fenotipi mandibola 11.
Embrioni di zebrafish offrono molti vantaggi evolutivi e genetici per lo studio dettagliato della cartilagine morfogenesi di Meckel. Il loro trattabilità genetica, la trasparenza, ex vivo e rapido sviluppo sono potenti vantaggi prestito bene per l'osservazione del movimento e l'organizzazione delle cellule per l'imaging dal vivo 6. L'utilizzo di strumenti di lineage tracing, come SOX10: Kaede linea transgenica, noi e altri abbiamo delineato le origini della cresta neurale dello scheletro cranio embrionale 1,5. Using il SOX10: ERT2-Cre con la ubi: linea transgenica Zebrabow-M, è ora possibile esplorare i dettagli dei movimenti cellulari durante lo sviluppo craniofacciale. Il Zebrabow-M, è una linea transgenica ingegnerizzata con il promotore ubiquitina guidare l'espressione di diversi fluorofori, ogni fiancheggiato da siti Lox 8. Il Zebrabow-M predefinita fluoroforo è rosso, che esprime RFP. Dopo l'induzione di espressione Cre, il Zebrabow-M costrutto ricombina e le cellule esprimono una combinazione di diversi fluorofori (RFP, CFP e YFP) creando espressione multispettrale nell'embrione. Tutte le cellule figlie che dividono dalle cellule marcate dopo l'evento di ricombinazione sono poi clonale etichettati, in modo che le popolazioni di cellule che derivano da diverse progenitori giustapposte sono clonale etichettati. Con questa marcatura cellulare clonazione, cellule proliferazione e migrazione con risoluzione clonale può essere seguito (figura 1 e 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Alcian blue linee transgeniche e fotoconvertibile come descritto sopra complementi tra loro per definire il complesso processo di cartilagine e sviluppo osseo. Tuttavia, la migrazione cellulare dal vivo e organizzazione durante l'organogenesi è stato a lungo ipotizzato e dimostrato indirettamente ma mai visualizzato. Linea transgenica Zebrabow-M accoppiata con una cartilagine specifica Cre permette simultaneamente l'osservazione dal vivo di tutti questi eventi distinti coinvolti nella formazione delle ossa e de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Alex Schier per gentilmente condividere la linea transgenica Zebrabow-M, Geoffrey Burns per il vettore pDEST e Renee Ethier-Daigle per un'eccellente cura della struttura pesce e le linee.
FINANZIAMENTO:
Siamo grati per il generoso sostegno finanziamento NIDCR RO3DE024490 e Shriners Hospitals for Children (ECL) e borse di formazione post-dottorato da Shriners Hospitals for Children (LR e YK).
Materials
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μL stock aliquots at 50mg/mL |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Equipments | |||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
References
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