التصور من خلية غضروفية بيوم إضافي والاتجاه انتشار عبر Zebrabow تحليل الخلية نسيلي في الغضروف والجنينية ميكل
Summary
منذ فترة طويلة افترض تنظيم خلية من خلايا العظام القحفي ولكن لم تصور مباشرة. وضع العلامات خلية متعددة الأطياف والحية على الهواء مباشرة التصوير يسمح التصور من سلوك الخلية الحيوي في الفك السفلي الزرد. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول للتلاعب Zebrabow الأسماك المعدلة وراثيا ومراقبة مباشرة إقحام خلية والتغيرات المورفولوجية للغضروفية في غضروف ميكل.
Abstract
تطوير الهياكل القحفي الفقارية يتطلب التنسيق الدقيق للهجرة الخلايا وانتشار، الالتصاق والتمايز. الزخرفة من غضروف ميكل، والبلعوم الأولى قوس مشتق، ينطوي على الهجرة من قمة العصبية في الجمجمة (CNC) خلايا والتدريجي التقسيم وانتشارها وتنظيم غضروفية متباينة. وقد وصفت عدة دراسات الهجرة CNC خلال أقل التشكل الفك، ولكن تفاصيل كيفية غضروفية تحقيق التنظيم في النمو وتوسيع غضروف ميكل لا يزال غير واضح. وsox10 المقيدة والتي يسببها كيميائيا لجنة المساواة العرقية بوساطة recombinase إعادة التركيب يولد التباديل من البروتينات الفلورية متميزة (RFP، YFP وCFP)، وبالتالي خلق وضع العلامات المتعددة الأطياف من الخلايا الاولية وذريتهم، مما يعكس السكان نسيلي متميزة. باستخدام متحد البؤر الوقت الفاصل بين التصوير الفوتوغرافي، فمن الممكن لمراقبة غضروفية behaviأو أثناء وضع الغضروف الزرد ميكل.
وضع العلامات الخلية متعدد الأطياف تمكن العلماء من إثبات تمديد غضروفية وميكل. خلال مرحلة تمديد غضروف ميكل الذي ينبئ الفك السفلي، غضروفية يقحم لإحداث تمديد لأنها كومة في خلية واحدة في الصف الطبقات تنظيما. فشل هذه العملية الإقحام المنظمة للتوسط تمديد خلية يوفر التفسير الآلي الخلوي للفك السفلي عن نقص التنسج التي نلاحظها في تشوهات الفك السفلي.
Introduction
وتتطلب التنمية القحفي الجزيئية، والتفاعلات الخلوية والأنسجة المعقدة لدفع تكاثر الخلايا، والهجرة والتمايز 1،2، 3. هذه عملية منظمة بإحكام ومعقدة وتخضع لاضطرابات وراثية وبيئية، بحيث تشوهات القحفي هي من بين تشوهات المواليد الأكثر شيوعا 1-9. في حين لا تزال التدخلات الجراحية الدعامة الأساسية لعلاج الشذوذ القحفي، فهم أساس التنمية ضروري لابتكار علاجات في المستقبل. لذلك، ودراسة التشكل والآليات في التقارب والإرشاد والتكامل الخلية يقدم أفكارا جديدة في تشكيل الهيكل العظمي القحفي 1.
الجمجمة العصبية ترحيل قمة وملء أول البلعوم القوس، عمليات الفك السفلي ثم شكل تقرن التي تمتد لتشكيل غضروف ميكل الذي ينبئ الفك السفلي. التشكل سو غضروف ميكل يتطلب تنظيم خلية غضروفية عبر انتشار الاتجاه، الاستقطاب الخلايا والتمايز 1،10. ومع ذلك، فإن تعقيد تنظيم خلية غضروفية في النمو وتوسيع غضروف ميكل لا يزال غير واضح. فهم سلوك الخلية الحيوي أمر بالغ الأهمية لفهم التشوهات الخلقية التي تؤثر على حجم الفك السفلي، مثل الظواهر الفك السفلي مصبغ 11.
الأجنة الزرد توفر العديد من المزايا التنموية وراثية لدراسة مفصلة للغضروف ميكل التشكل. من قابلية الإستطراق الجيني، والشفافية، فيفو السابقين والتطور السريع مزايا قوية الإقراض جيدا لرصد حركة الخلايا والمنظمة من قبل التصوير الحي 6. باستخدام أدوات تتبع النسب، مثل sox10: خط المعدلة وراثيا Kaede الذي، نحن وغيرنا قد حددت أصول قمة العصبية الهيكل العظمي القحفي الجنينية 1،5. باليودنانوغرام sox10: ERT2-لجنة المساواة العرقية مع يو بي آي: Zebrabow-M خط المعدلة وراثيا، أصبح من الممكن الآن لاستكشاف تفاصيل الحركات الخلوية أثناء تطوير القحفي. وZebrabow-M، هو خط المعدلة وراثيا هندسيا مع المروج بتحول القيادة التعبير عن fluorophores مختلفة، ولكل يحيط بها مواقع السلمون المدخن 8. وfluorophore الافتراضي Zebrabow-M هو أحمر، معربا عن طلب تقديم العروض. بعد تحريض لجنة المساواة العرقية التعبير، وZebrabow-M بناء يعيد توحيد والخلايا التعبير عن مزيج من fluorophores مختلفة (RFP، CFP وYFP) خلق التعبير متعددة الأطياف في الجنين. كل الخلايا الوليدة التي تفرق من الخلايا المسمى بعد وقوع الحدث إعادة التركيب ثم يتم المسمى متطابق بسلالة، لذلك وصفت أن السكان الخلية التي تستمد من الأسلاف جنبا إلى جنب مختلفة متطابق بسلالة. من خلال هذا الوسم خلية الاستنساخ، وتكاثر الخلايا والهجرة مع قرار نسيلي يمكن اتباعها (الشكل 1 و 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوط المعدلة وراثيا الزرقاء وphotoconvertible الألسيان كما هو موضح أعلاه يكمل بعضها البعض لتحديد عملية معقدة من الغضاريف ونمو العظام. ومع ذلك، منذ فترة طويلة افترض الهجرة الخلوية الحية والمنظمة خلال توالد وغير مباشرة ولكن أثبتت تصور أبدا. Zebrabow-M خط المعدلة وراثيا إلى جانب و?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أشكر أليكس شير لتتكرم تقاسم خط Zebrabow-M المعدلة وراثيا، جيفري بيرنز للناقلات pDEST ورينيه ايتييه-ديغل] لرعاية ممتازة للمنشأة الأسماك والخطوط.
التمويل:
ونحن ممتنون للدعم السخي بتمويل من NIDCR RO3DE024490 ومستشفى شراينرز للأطفال (ECL) والزمالات التدريبية ما بعد الدكتوراه من مستشفى شراينرز للأطفال (LR وYK).
Materials
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μL stock aliquots at 50mg/mL |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Equipments | |||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
References
- Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140, 76-81 (2013).
- Dougherty, M., et al. Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model. The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).
- McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research. Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).
- Mossey, P. Dental education and CPD: are you being served. British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Vieira, A. R. . Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).
- Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development. PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).
- Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence. Teratology. 65, 116-120 (2002).
- Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, 3254-3265 (2013).
