ויזואליזציה של הכונדרוציטים עיבור וכיוונית למניעת הפצת נשק באמצעות ניתוח תא משובט Zebrabow בסחוס של העוברית מקל
Summary
ארגון תא של עצמות craniofacial כבר שיערו ארוך אבל אף פעם לא דמיין ישירות. תיוג תא Multi-רפאים ובשידור חי vivo הדמיה מאפשרת הדמיה של התנהגות הדינמית של תאים בלסת תחתונה דג הזברה. כאן, אנו פירוט הפרוטוקול לתמרן Zebrabow דג מהונדס וישירות להתבונן עיבור תא ושינויים מורפולוגיים של כונדרוציטים בסחוס של מקל.
Abstract
פיתוח של מבני craniofacial חוליות דורש תיאום מדויק של נדידת תאים, התפשטות, הדבקה ובידול. דפוסים של סחוס של מקל, נגזר קשת בלוע ראשון, כרוך בהגירה של תאי רכס עצבי גולגולתי (CNC) ומחיצות, ההפצה המתקדמת וארגון של כונדרוציטים מובחנים. מספר מחקרים שתוארו הגירת CNC במהלך המורפוגנזה לסת תחתונה, אבל את הפרטים של איך להשיג כונדרוציטים ארגון בצמיחה וההרחבה של הסחוס של מקל עדיין לא ברורים. Sox10 מוגבל ורקומבינציה בתיווך recombinase Cre המושרית כימי יוצרת תמורות של חלבונים שונים ניאון (RFP, YFP וCFP), ובכך ליצור תיוג רב-רפאים של תאי אב וצאצאיהם, המשקפת אוכלוסייה משובט שונה. באמצעות צילום הזמן לשגות confocal, ניתן לצפות בכונדרוציטים behaviאו במהלך הפיתוח של הסחוס של דג הזברה מקל.
תיוג תא Multispectral מאפשר למדענים להפגין סיומת של כונדרוציטים של מקל. במהלך שלב הארכה של סחוס של מקל, שבישר הלסת התחתונה, כונדרוציטים intercalate לבצע הרחבה כפי שהם המחסנית בשורה שכבתית תא בודד מאורגנת. כישלון של תהליך intercalating מאורגן זה לתווך הארכת תא מספק הסבר מכניסטי הסלולרי ללסת תחתונה היפופלסטי שאנו רואים במומי לסת.
Introduction
פיתוח Craniofacial דורש אינטראקציות מולקולריות, תאיות ורקמות מורכבות לנהוג התפשטות תאים, הגירה ובידול 1,2, 3. תהליך מוסדר היטב ומורכב זה כפוף להפרעות גנטיות וסביבתיות, כגון שעיוותי craniofacial הן בין המומים הלידה הנפוצים ביותר 1-9. בעוד התערבות כירורגית להישאר התווך של טיפול בחריגות craniofacial, הבנת בסיס הפיתוח הוא חיוני לחדש טיפולים עתידיים. לכן, לימוד המורפוגנזה והמנגנונים בהתכנסות והרחבה והאינטגרציה תא מספק תובנות רומן להיווצרות של שלד craniofacial 1.
להגר רכס העצבי גולגולתי ולאכלס את קשת בלוע הראשונה, תהליכי לסת אז טופס לזווג שמרחיבים לטופס סחוס של מקל, שבישר הלסת התחתונה. o המורפוגנזהF הסחוס של מקל דורש ארגון הכונדרוציטים באמצעות התפשטות כיוונית, קיטוב התא ו1,10 בידול. עם זאת, המורכבות של ארגון הכונדרוציטים בצמיחה וההרחבה של הסחוס של מקל עדיין לא ברורות. ההבנה דינמית התנהגות תא היא קריטית להבנת מומים מולדים המשפיעים על גודל לסת, כגון פנוטיפים לסת תחתונה היפופלסטי 11.
עוברי דג הזברה מציעים יתרונות רבים התפתחותיים וגנטיים למחקר מפורט של המורפוגנזה הסחוס של מקל. נְהִילוּת הגנטית, שקיפות, vivo לשעבר והתפתחות מהירה הן יתרונות חזקים הלוואות זה טוב להתבוננות בתנועת תא וארגון על ידי הדמיה חיה 6. שימוש בכלי התחקות שושלת, כגון sox10: קו מהונדס קאאד, אנו ואחרים התוו את מקורות רכס העצביים של שלד craniofacial העוברי 1,5. Using sox10: ERT2-Cre עם UBI: קו מהונדס Zebrabow-M, ניתן כיום לחקור את הפרטים של תנועות סלולריות במהלך פיתוח craniofacial. Zebrabow-M, הוא קו מהונדס מהונדס עם אמרגן היוביקוויטין נהיגה הביטוי של fluorophores שונה, כל אחד מוקף אתרי קס 8. Fluorophore ברירת מחדל Zebrabow-M הוא אדום, להביע RFP. לאחר האינדוקציה של ביטוי Cre, Zebrabow-M לבנות משתלבת מחדש ותאים להביע שילוב של fluorophores שונה (RFP, CFP ו YFP) יצירת ביטוי רב-רפאים בעובר. כל תאי הבת שלחלק מהתאים שכותרתו לאחר אירוע רקומבינציה לאחר מכן כותרת clonally, כך שאוכלוסיות התאים שנובעות מאבות סמיכותם שונים מסומנות clonally. על ידי תיוג תא שיבוט זה, התפשטות תאים ונדידה עם רזולוציה משובט יכולים להיות אחרי (איור 1 ו -2).
Protocol
Representative Results
Discussion
קווים מהונדסים כחולים וphotoconvertible Alcian כפי שתואר לעיל משלים אחד את השני כדי להגדיר את התהליך המורכב של סחוס ועצם פיתוח. עם זאת, העברת חיה סלולרית וארגון במהלך organogenesis כבר שיערו ארוכה ובעקיפין הפגינו אבל מעולם לא דמיינו. קו מהונדס Zebrabow-M בשילוב עם סחוס Cre הספציפי מאפשר תצפ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים אלכס Schier לחביבות שיתוף הקו המהונדס Zebrabow-M, ג'פרי ברנס לוקטור pDEST ורנה Ethier-Daigle לטיפול מצוין של מתקן הדגים וקווים.
מימון:
אנו מודים לתמיכה נדיבה מימון מNIDCR RO3DE024490 ובתי החולים ריינרים לילדים (ECL) ומלגות הכשרת פוסט-דוקטורט מבתי החולים ריינרים לילדים (LR וי.ק.).
Materials
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μL stock aliquots at 50mg/mL |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Equipments | |||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
References
- Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140, 76-81 (2013).
- Dougherty, M., et al. Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model. The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).
- McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research. Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).
- Mossey, P. Dental education and CPD: are you being served. British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Vieira, A. R. . Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).
- Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development. PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).
- Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence. Teratology. 65, 116-120 (2002).
- Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, 3254-3265 (2013).
