Visualisierung von Chondrozyten-Einlagerung und Directional Verbreitung über Zebrabow klonalen Zellanalyse in der embryonalen Meckel-Knorpel
Summary
Zellorganisation von Gesichtsschädelknochen war lange vermutet worden, aber nie direkt sichtbar gemacht. Multi-Spektral-Zellmarkierung und in vivo-Live- Bildgebung ermöglicht Visualisierung dynamischer Zellverhalten im Zebrafisch Unterkiefer. Hier haben wir ausführlich das Protokoll zu manipulieren Zebrabow transgene Fische und direkt zu beobachten Zell Einlagerung und morphologischen Veränderungen der Knorpelzellen in der Meckel-Knorpel.
Abstract
Entwicklung der Wirbeltiere kraniofazialen Strukturen erfordert eine genaue Abstimmung der Zellmigration, Proliferation, Adhäsion und Differenzierung. Strukturieren der Meckel-Knorpel, einem ersten Schlundbogen-Derivat, beinhaltet die Migration der Schädel Neuralleiste (CNC) Zellen und die fortschreitende Partitionierung, Proliferation und Organisation von differenzierten Chondrozyten. Mehrere Studien haben CNC Migration während der Unterkiefer Morphogenese beschrieben, aber die Details, wie die Chondrozyten zu erreichen Organisation in das Wachstum und die Erweiterung der Meckel-Knorpel, bleibt unklar. Die Sox10 beschränkt und chemisch induzierte Cre-Rekombinase-vermittelte Rekombination erzeugt Permutationen von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen (RFP, YFP und CFP), wodurch die Schaffung eines multispektralen Kennzeichnung von Vorläuferzellen und deren Nachkommen, was deutliche Klonpopulationen. Mittels konfokaler Zeitraffer-Fotografie, ist es möglich, die Chondrozyten beobachten behavioder während der Entwicklung des Zebrafisches Meckel-Knorpel.
Multispektrale Zellmarkierung ermöglicht es Wissenschaftlern auf eine Verlängerung des Meckel-Chondrozyten zu demonstrieren. Während der Extensionsphase des Meckel-Knorpel, der den Unterkiefer vorwegnimmt, interkalieren Chondrozyten zu Verlängerung zu bewirken, wie sie in einer organisierten Einzelzellschicht Reihe stapeln. Die Nichtbeachtung dieser organisierten interkalierenden Prozess zur Zellerweiterung vermitteln, bietet das Mobil mechanistische Erklärung für die hypoplastischen Unterkiefer, die wir in der Unterkieferfehlbildungen zu beobachten.
Introduction
Kraniofazialen Entwicklung erfordert komplexe molekularer, zellulärer und Gewebe-Wechselwirkungen, die Zellproliferation, Migration und Differenzierung 1,2, 3 fahren. Diese streng reguliert und komplexer Prozess unterliegt genetischen und umweltbedingten Störungen, so dass kraniofazialen Fehlbildungen gehören zu den häufigsten Geburtsfehlbildungen 1-9. Während chirurgischer Eingriffe bleiben die Hauptstütze der Behandlung für kraniofaziale Anomalien, das Verständnis der Entwicklung Basis ist wichtig, um zukünftige Therapien zu innovieren. Daher Studium der Morphogenese und die Mechanismen in der Konvergenz und der Erweiterung und Zell Integration bietet neue Einblicke in die Bildung des kraniofazialen Skeletts 1.
Schädel Neuralleiste migrieren und Füllen der ersten Schlundbogen, dann gepaart bilden Kiefer Prozesse, die zur Meckel-Knorpel, der den Unterkiefer vorwegnimmt bilden verlängern. Morphogenese of der Meckel-Knorpel benötigt Chondrozyten-Organisation über Richtungsproliferation, Zellpolarisation und Differenzierung 1,10. Allerdings bleibt die Komplexität der Chondrozyten-Organisation in das Wachstum und die Erweiterung des Meckel-Knorpel unklar. Grundlegendes zu dynamischen Zellverhalten ist entscheidend für das Verständnis angeborene Fehlbildungen betroffen Kiefergröße, wie hypoplastische Mandibula Phänotypen 11.
Zebrafischembryonen bieten viele Entwicklungs- und genetische Vorteile für die detaillierte Untersuchung der Meckel-Knorpel Morphogenese. Ihre genetische Lenkbarkeit, Transparenz, ex vivo und schnelle Entwicklung sind leistungsstarke Vorteile verleiht ihm auch zur Beobachtung der Zellbewegung und Organisation von Live-Imaging-6. Verwendung Linie-Tracing-Tools, wie Sox10: kaede transgene Linie, haben wir und andere der Neuralleiste Ursprünge der embryonalen kraniofazialen Skeletts 1,5 abgegrenzt. Using der Sox10: ERT2-Cre mit dem ubi: Zebrabow-M transgene Linie, ist es nun möglich, um Details des Zellbewegungen während kraniofazialen Entwicklung zu erforschen. Die Zebrabow-M, eine transgene Linie mit der Ubiquitin-Promotor, der die Expression von verschiedenen Fluorophore, die jeweils von Lox-Stellen flankiert 8 entwickelt. Die Zebrabow-M Standard Fluorophor Rot, RFP ausdrückt. Nach Induktion der Cre-Expression, die Zebrabow-M zu konstruieren rekombiniert und Zellen exprimieren eine Kombination von verschiedenen Fluorophoren (RFP, CFP und YFP) Erzeugen multispektraler Expression im Embryo. Alle Tochterzellen, die von den markierten Zellen nach dem Rekombinationsereignis teilen werden dann klonal beschriftet, so dass die Zellpopulationen, die aus verschiedenen nebeneinander liegenden Vorläuferzellen abgeleitet werden klonal beschriftet. Durch diese Klonierung Markierung von Zellen, können die Zellen-Proliferation und Migration mit klonaler Auflösung (Abbildung 1 und 2) eingehalten werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alcianblau und Photokonvertierbare transgenen Linien wie oben beschrieben, gegenseitig ergänzt den komplizierten Prozess der Knorpel- und Knochenentwicklung zu bestimmen. Allerdings hat Live-Zellmigration und Organisation während der Organogenese lange vermutet worden und indirekt nachgewiesen, aber nie visualisiert. Zebrabow-M transgene Linie gepaart mit einer Knorpel spezifischen Cre ermöglicht die gleichzeitige Live-Beobachtung aller dieser verschiedenen Ereignisse im Knochen- und Knorpelbildung beteiligt. Diese T…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Alex Schier für die freundliche Aufteilung der Zebrabow-M transgene Linie, Geoffrey Verbrennungen für den pDest Vektor und Renee Ethier-Daigle für hervorragende Betreuung der Fische Anlage und Leitungen.
FINANZIERUNG:
Wir sind dankbar für die großzügige finanzielle Unterstützung von NIDCR RO3DE024490 und Shriners Hospitals for Children (ECL) und Post-Doc-Ausbildungsstipendien von Shriners Hospitals for Children (LR und YK).
Materials
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μL stock aliquots at 50mg/mL |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Equipments | |||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
References
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