Ganglios de raíz dorsal neuronas y las células madre derivadas de la adiposa diferenciada: Un<em> In Vitro</em> Co-cultivo modelo para estudiar la regeneración de los nervios periféricos

NOTA: Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los Animales del Reino Unido (Procedimientos Científicos), de 1986. 1. experimental Antes de comenzar los tejidos y células de la cosecha, comprobar que todas las herramientas son estériles. Si es necesario, el autoclave un par de tijeras quirúrgicas agudas, una muy finas pinzas y unas pinzas finas estándar. También esterilizar cada sustrato antes de la siembra de células usando la esterilización UV, la exposición etanol o la esterilización por vapor según sea apropiado. Preparación de los medios de comunicación para la cosecha de células madre y la diferenciación Preparar el medio de crecimiento de células madre, que contiene medio esencial mínimo (α-MEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 200 mM L-glutamina, y 1% de penicilina-estreptomicina (PS). Preparar una solución madre 10 mM de forskolina disolviendo 10 mg de forskolina en 2.436 ml de sulfóxido de dimetilo estéril. Usar a una concentración final de 14 mM. </ Li> Preparar una solución madre de 35 mg / ml de ácido retinoico mediante la disolución de 50 mg en 1,43 ml de sulfóxido de dimetilo estéril. Utilice a una concentración final de 350 ng / ml. Preparar el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) existencias (100 mg / ml) disolviendo 10 g de polvo liofilizado en 100 l de agua estéril destilada. Utilice a una concentración final de 5 ng / ml. Preparar el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) existencias (100 mg / ml) disolviendo 50 g de polvo liofilizado en 500 l de agua estéril destilada. Utilice a una concentración final de 10 ng / ml. Preparar el medio de diferenciación de células madre, que contiene medio de crecimiento de células madre suplementado con 14 mM de forskolina, 126 ng / factor de crecimiento glial-2 (GGF-2), 5 ng / ml de factor de crecimiento derivado de plaquetas ml (PDGF), y 10 ng / ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF). Preparación de medios de comunicación y soluciones de reserva para la cosecha de la neurona y disociación Preparar Bottenstein y de Sato (BS) medio de 28 años, mediante la adición de 1% PS y 1% de suplemento N2 a medio F12 de Ham. Calcular el volumen final necesario como 500 l por pocillo (si se utiliza una placa de 24 pocillos). Preparar las poblaciones de colagenasa IV en medio F12 de Ham a la concentración de 1,25% p / v. Filtro-esterilizar la solución y se almacena a -20 ° C hasta 200 alícuotas mL. Preparar las existencias de tripsina pancreática bovina en medio F12 de Ham en la concentración de 2,5% p / v, filtro de esterilizar y almacenar a -20 ° C hasta 200 ml de alícuotas. Preparar el factor de crecimiento nervioso (NGF) solución madre a la concentración de 5 mg / ml en un filtro esterilizado 1 mg / solución de albúmina de suero bovino libre de ácido graso ml (BSA) en medio F12 y almacenar a -20 C como 200 l alícuotas. No filtrado del NGF después de la reconstitución. En caso de modificación de la superficie no se ha realizado, cubreobjetos capa / placas con poli-D-lisina (0,1 mg / ml durante 15 min a RT) Y / o laminina (2-10 g / cm 2 durante 2 horas a 37 ° C) para soportar la unión de la neurona y el crecimiento de neuritas, según proceda. Siempre caliente los medios de comunicación en un baño de agua a 37 ° C antes de usar. 2. derivadas de tejido adiposo de células madre (ASC) Cosecha y diferenciación en un fenotipo SC Cosecha de ASC de la grasa visceral y inguinal de ratas macho adultas Sprague-Dawley Antes de comenzar, prepare un tubo con 10-15 ml de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) suplementado con 1% v / v de la solución de PS y almacenar en hielo hasta la cosecha de grasa. Terminar la rata por dislocación cervical y decapitación. Afeitarse la rata y hacer una incisión a través de la piel abdominal, exponiendo los órganos internos y evitar el sangrado. Retire la grasa visceral que encierra el estómago y los intestinos (por lo general se caracteriza por una consistencia de color amarillo graso) y la grasa inguinal rodea los testículos de un adulto de sexo masculino Sprague-Dawley. º Transferenciae grasa en el tubo que contiene HBSS en hielo. En una cabina de seguridad biológica (clase II) picar finamente la grasa usando un par de tijeras y una cuchilla de afeitar estéril hasta obtener la consistencia fina que se alcanza y la transfiere en un tubo que contiene 15 ml de 0,2% p / v solución de colagenasa tipo I recién preparada y esterilizada por filtración en el día. Transferir el tubo en un baño de agua a 37 ° C y dejar el tejido graso de digerir en presencia de la enzima durante 30 min-1 h bajo agitación continua. Monitorear la digestión de cerca y detenga antes de que el tejido está completamente disociado, esto mejorará la viabilidad celular y rendimiento celular. Filtro Theun-disociado del tejido a través de un filtro de células de 100 micras. NOTA: La buena digestión tejido dará lugar a la consistencia homogénea de la grasa, visible a simple vista cuando agitando suavemente el tubo, adquiriendo un aspecto amarillento. Neutralizar la enzima mediante la adición de 15 ml de medio de crecimiento de células madre que contienen suero fetal bovino a 37 ° C y centrifugar elsolución a 160 g durante 10 min con el fin de recoger la fracción vascular del estroma, incluyendo las células madre, en la parte inferior del tubo. En esta etapa, el sedimento puede ser resuspendido en 1 ml de células rojas de la sangre tampón de lisis para eliminar la contaminación de células sanguíneas. Después de la resuspensión y pipeteo durante 1 min, añadir 10 ml de medio de crecimiento de células madre fresca y centrifugar a 160 g durante 10 min. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante del tubo, teniendo cuidado de la pella celular depositada en la parte inferior. Resuspender las células en 10 ml de medio de crecimiento de células madre, transferirlos en un 75 cm 2 frascos y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2. Mantener las células a niveles sub-confluentes hasta el paso 1-2, el cambio de medio cada 3 días. La diferenciación ASC a un fenotipo SC En el paso 1-2, retire el medio de cultivo de células madre del matraz de 75 cm2 y reemplazarlo con 10 ml de medio fresco que contiene 1 mM β-mercaptoetanol recién preparojo y esterilizada por filtración en el día. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 24 horas. En esta etapa, es importante que las células se sembraron a baja densidad (30%) antes de iniciar la diferenciación. Lavar las células cuidadosamente con HBSS, aspirado y reemplazarlo con 10 ml de medio que contenía 350 ng de ácido retinoico / ml. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 72 horas. Trate de minimizar la exposición del medio celular a la luz. Después de 3 días, se lavan las células con cuidado con HBSS, aspirado y reemplazarlo con 10 ml de medio de diferenciación de células madre (véase el paso 1.2.6). Mantener las células a nivel sub-confluentes, cambiando el medio cada 3 días. NOTA: Después de 2 semanas de incubación, ASC se diferencian en-SC como ASC, expresando su fenotipo característico (como lo demuestra Kingham et al 5.). Ellos pueden ser utilizados hasta el décimo paso sin cambios notables en el comportamiento 29. <p class = "jove_title"> 3. Cosecha y disociación de ganglios de la raíz dorsal (GRD) neuronas Terminar la rata por dislocación cervical y decapitación. Afeitarse la rata y levantar la piel para exponer la columna vertebral. Con unas tijeras afiladas, excide la columna vertebral teniendo especial cuidado de los órganos confinados y los vasos sanguíneos. Transferir la columna vertebral en una cabina de seguridad biológica (clase II), utilizando una placa de Petri y eliminar cualquier parte dorsal. Divida la columna vertebral en medio a lo largo del eje longitudinal con unas tijeras quirúrgicas estériles y afilados para exponer el tejido del cordón. En este punto, es útil para cortar la columna vertebral en dos segmentos más pequeños por debajo del nivel de la caja torácica, para que sea más fácil de manejar durante la cosecha de la neurona DRG. Con unas pinzas finas, retire con cuidado todo el tejido de la médula, prestando atención a no tirar y eliminar las raíces DRG. De esta manera el DRG y las raíces serán expuestos dentro de los canales vertebrales, todavía encerrado en la columna. Observe DRG como filamentos blancos coming directamente de los canales. Saque toda la raíz DRG (no sólo la DRG) de los canales vertebrales utilizando pinzas muy finas, de profundizar en los canales vertebrales y teniendo cuidado de no dañar las raíces de los ganglios. Transferir el DRG en una pequeña placa de Petri (60 mm 2) que contiene 3-4 ml de medio F12 de Ham suplementado con 1% de PS. Si el uso de diferentes animales, utilizar platos separados. Bajo un microscopio de disección, limpie el GRD de cualquier exceso de las raíces nerviosas que rodean los ganglios usando pinzas estériles y un bisturí para reducir la contaminación de las células gliales. Transferir el DRG en una pequeña placa de Petri (35 mm 2) con 1,8 ml de medio F12 fresco. Añadir 200 l de solución de p / v colagenasa tipo IV de stock 1,25% (concentración final de 0,125%) y se incuba la DRG a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 1 hr. Aspirar con cuidado el medio con una pipeta de vidrio, teniendo cuidado de no aspirar ni dañe la DRG. Añadir medio F12 fresco flexiblementado con 0,125% p / v colagenasa tipo IV de la enzima y se incuba durante 1 hora como se describe anteriormente. Aspirar el medio y lavar suavemente el DRG con medio F12. Añadir a continuación 1,8 ml de medio F12 y 200 l de tripsina (concentración final de 0,25% p / v) y se incuba a 37 ° C, 5% de CO2 durante 30 min. Retire la tripsina y añadir 1 ml de medio F12 suplementado con 500 l de FBS para detener la reacción enzimática. Aspirar el medio y lavar suavemente el DRG con medio F12 de tres veces para eliminar las trazas de suero. Añadir 2 ml de medio F12 fresco y transferir cuidadosamente la DRG con el medio en un tubo de 15 ml usando una pipeta de vidrio. Disociar suavemente las neuronas DRG pipeteando arriba y abajo (cerca de 8-10 veces) con la pipeta de vidrio (puntas de plástico se pueden utilizar como alternativa). Dejar que el precipitado se asiente en la parte inferior del tubo y recoger el medio en un tubo nuevo. Añadir 2 ml de medio F12 fresco al tubo que contiene el sedimento y repetir el mdisociación echanical con la pipeta de vidrio. Repita este paso hasta que la suspensión se convierte homogéneos (3-4 veces) y recoger todo el DRG disociado en el nuevo tubo. Este método reduce la presión derivada de la disociación mecánica y mejora la viabilidad de las neuronas. Se filtra la suspensión homogeneizada resultante en un nuevo tubo de 15 ml usando un colador micras celular 100 para eliminar las neuronas disociadas-un y otros desechos. En esta etapa, puede ser conveniente filtrar primero la suspensión de células en un tubo de 50 ml y luego transferir la solución en el tubo más pequeño usando una pipeta de vidrio. Centrifugar la suspensión a 110 g durante 5 min. Preparar una albúmina de suero bovino al 15% (BSA) mediante la adición de 500 l de una solución de BSA al 30% a 500 l de medio F12. Poco a poco la pipeta la solución por la pared de un tubo de 15 ml para crear un rastro proteína gradual. En esta etapa, es útil para mantener el tubo en un ángulo de 45 ° y lentamente liberar el BSA usando los números deel tubo Falcon como referencia para la "pista" de formación. Aspirar el sobrenadante de la etapa 3.10 dejando 500 l en la parte inferior del tubo y resuspender el sedimento celular en el mismo medio. Lentamente pipetear la suspensión por el sendero de proteínas previamente preparada en el paso 3.11 (usar los números en el tubo como referencia) y se centrifuga a 500 g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de medio de BS modificado (o un medio mixto para la ASC / DRG co-cultivo-SC similares, tal como se describe a continuación en el paso 4.5. NOTA: El volumen de volver a suspender las neuronas DRG se puede hacer hasta el volumen real requerido, dependiendo de la concentración celular final deseada y el número de muestras a ser sembradas. Un animal proporcionará suficientes células para un experimento de 24 pocillos de placas. Incubar las muestras sembradas a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 2 horas para permitir la unión celular y, finalmente, se añade medio fresco suplementado con BS 50 ng / ml de FA de crecimiento nerviosoctor (NGF). 4. Dirigir Co-cultura de-SC como ASC y DRG neuronas Mantener ASC-SC como en la cultura a nivel sub-confluente como se describe en el paso 2.2.3. Veinticuatro horas antes de la cosecha DRG, aspirar el medio de diferenciación de células madre y lavar las células con HBSS. Aspirar y se incuba en 3 ml de tripsina a 37 ° C, 5% de CO2 durante 3 min. Revisar bajo un microscopio de luz que todas las células se han desprendido del matraz. Golpear suavemente el frasco para ayudar a la separación. Añadir 7 ml de medio para detener la reacción tripsina, recoger la suspensión de células en un tubo de 15 ml y centrifugar a 110 g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 5 ml de medio de diferenciación de células madre. Contar las células usando un hemocitómetro y se diluye la suspensión celular de acuerdo con la concentración final requerida. Idealmente, la siembra de 20.000 SC como ASC / cm 2 garantizaría una capa confluente de células. Sembrar el SC-comoASC sobre el sustrato y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 24 horas para permitir la unión celular. Después de 24 horas de incubación, aspirar el medio y agregue las neuronas DRG en la parte superior de las células como se describe en el paso 3.14 y 3.15. Cambiar el medio a un medio mixto que contiene 50% de medio de diferenciación de células madre y 50% de medio de BS. Además, la reducción de la concentración de FBS al 1-2,5% en el medio mezclada final ayuda a evitar la proliferación de contaminación de las células satélite derivados de la disociación DRG. Incubar las muestras co-cultivadas a 37 ° C, 5% de CO2 y mantener en cultivo durante el tiempo requerido para las pruebas futuras.