Gangli neuroni e cellule staminali derivate da tessuto adiposo differenziata: An<em> In Vitro</em> Co-coltura modello per studiare Peripheral Nerve Regeneration

NOTA: Tutti gli esperimenti su animali sono stati eseguiti in conformità con gli animali del Regno Unito (procedure scientifiche) Act, 1986. 1. set-up sperimentale Prima di iniziare a tessuti e delle cellule di raccolta, controllare che tutti gli strumenti sono sterili. Se necessario, sterilizzare in autoclave un paio di forbici chirurgiche Sharp, molto fine pinza e una pinza sottile standard. Sterilizzare anche ogni substrato prima semina cella utilizzando la sterilizzazione UV, l'esposizione etanolo o la sterilizzazione a vapore a seconda dei casi. Preparazione di terreni per la raccolta delle cellule staminali e la differenziazione Preparare il terreno di coltura di cellule staminali, contenente terreno minimo essenziale (α-MEM) addizionato con siero fetale bovino al 10% (FBS), 200 mm L-glutammina, e l'1% di penicillina-streptomicina (PS). Preparare una soluzione madre di 10 mm in forskolin sciogliendo 10 mg di forskolina in 2.436 ml di sterile dimetil sulfoxyde. Utilizzare a concentrazione finale di 14 micron. </ Li> Preparare una / soluzione madre ml 35 mg di acido retinoico sciogliendo 50 mg in 1,43 ml di sterile dimetil sulfoxyde. Utilizzare a concentrazione finale di 350 ng / ml. Preparare il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) scorte (100 mg / ml) sciogliendo 10 mg di polvere liofilizzata in 100 ml di acqua distillata sterile. Utilizzare a una concentrazione finale di 5 ng / ml. Preparare base del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF) scorte (100 mg / ml) sciogliendo 50 mg di polvere liofilizzata in 500 ml di acqua distillata sterile. Utilizzare a una concentrazione finale di 10 ng / ml. Preparare il mezzo di differenziazione delle cellule staminali, contenenti mezzo di crescita delle cellule staminali integrato con 14 micron forskolin, 126 ng / ml di crescita gliale fattore-2 (GGF-2), 5 ng / mL di derivazione piastrinica fattore di crescita (PDGF), e 10 ng / ml di base del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF). Preparazione dei media e soluzioni madre per la raccolta neurone e dissociazione Preparare BottenstEin e di Sato (BS) medio 28, con l'aggiunta di 1% PS e l'1% supplemento N2 medio F12 di Ham. Calcolare il volume finale necessario come 500 microlitri per bene (se si utilizza un 24-pozzetti). Preparare scorte collagenasi IV in mezzo F12 di Ham alla concentrazione di 1,25% in peso / v. Filtro-sterilizzare la soluzione e conservare a -20 ° C in 200 microlitri aliquote. Preparare bovina scorte tripsina pancreatiche in mezzo F12 di Ham alla concentrazione di 2,5% in peso / v, filtro sterilizzare e conservare a -20 ° C in 200 microlitri aliquote. Preparare il fattore di crescita nervoso (NGF) soluzione madre alla concentrazione di 5 mg / ml in un filtro sterilizzata 1 mg / ml soluzione grassi liberi-acido di siero albumina bovina (BSA) in mezzo F12 e conservare a -20 C come 200 microlitri aliquote. Non filtrata del NGF dopo la ricostituzione. Nel caso in cui nessuna modifica della superficie è stata eseguita, vetrini cappotto / piastre con poli-D-lisina (0,1 mg / ml per 15 minuti a temperatura ambiente) E / o laminina (2-10 mg / cm 2 per 2 ore a 37 ° C) per supportare attaccamento neurone e crescita dei neuriti come appropriato. Sempre scaldare media in un bagno d'acqua a 37 ° C prima dell'uso. 2. derivate da tessuto adiposo cellule staminali (ASC) Harvest e differenziazione in un fenotipo SC ASC raccolta dal grasso viscerale e inguinale dell'adulto maschio ratti Sprague-Dawley Prima di iniziare, preparare una provetta con 10-15 ml di Hanks 'Balanced soluzione salina (HBSS) supplementato con 1% v / v della soluzione di PS e conservare in ghiaccio fino grasso raccolta. Terminare il ratto per dislocazione cervicale e decapitazione. Shave ratto ed effettuare una incisione attraverso la pelle addominale, esponendo gli organi interni ed evitando sanguinamento. Rimuovere il grasso viscerale che racchiude lo stomaco e l'intestino (solitamente caratterizzato da una consistenza grassa gialla) e il grasso inguinale che circonda i testicoli di un maschio adulto Sprague-Dawley di ratto. Trasferimento the grassi nel tubo contenente HBSS su ghiaccio. In un armadio di sicurezza biologica (classe II) tritare finemente il grasso con un paio di forbici e una lama di rasoio sterile fino a consistenza bene raggiungimento e trasferirlo in una provetta contenente 15 ml di 0,2% preparata peso / v soluzione di tipo I e collagenasi sterilizzata per filtrazione il giorno. Trasferire la provetta in un bagno d'acqua a 37 ° C e lasciare il tessuto adiposo di digerire in presenza dell'enzima per 30 min-1 hr sotto agitazione continua. Monitorare attentamente la digestione e fermare prima che il tessuto è completamente dissociato, questo migliorerà la vitalità delle cellule e la resa delle cellule. Tessuto Filter Theun-dissociato attraverso un colino cella 100 micron. NOTA: Una buona digestione del tessuto comporta consistenza omogenea del grasso, visibile a occhio quando agitando delicatamente il tubo, acquisendo un aspetto beige. Neutralizzare l'enzima aggiungendo 15 ml di terreno di coltura di cellule staminali contenenti siero fetale bovino a 37 ° C e centrifugaresoluzione a 160 g per 10 minuti per raccogliere la frazione stromale vascolare, comprese le cellule staminali, sul fondo della provetta. In questa fase, il pellet può essere risospeso in 1 ml di globuli rossi Lysis Buffer per eliminare la contaminazione globuli. Dopo la risospensione e pipettaggio per 1 minuto, aggiungere 10 ml di fresco mezzo di crescita delle cellule staminali e centrifugare a 160 g per 10 min. Attenzione aspirare il surnatante dal tubo, curando il pellet cellulare depositato sul fondo. Risospendere le cellule in 10 ml di terreno di coltura di cellule staminali, trasferirli in 75 cm 2 palloni e incubare a 37 ° C, 5% CO 2. Mantenere le cellule a livello sub-confluenti fino passaggio 1-2, cambiando media ogni 3 giorni. ASC differenziazione di un fenotipo SC Al passaggio 1-2, rimuovere il mezzo di crescita delle cellule staminali dal pallone 75 centimetri 2 e sostituirlo con 10 ml di mezzo fresco contenente 1 mM β-mercaptoetanolo appena preparosso e sterilizzata per filtrazione il giorno. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 per 24 ore. In questa fase, è importante che le cellule sono seminate a bassa densità (30%) prima di iniziare la differenziazione. Lavare le cellule accuratamente con HBSS, aspirare e sostituirlo con 10 ml di mezzo contenente 350 ng / ml acido retinoico. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 per 72 ore. Cercare di ridurre al minimo l'esposizione di medio cellule alla luce. Dopo 3 giorni, lavare le cellule accuratamente con HBSS, aspirare e sostituirlo con 10 ml di staminali medio differenziazione cellulare (vedi punto 1.2.6). Mantenere le cellule a livelli sub-confluenti, cambiando media ogni 3 giorni. NOTA: Dopo 2 settimane di incubazione, ASC sono differenziati in SC-come ASC, esprimendo la loro caratteristica fenotipo (come dimostrato da Kingham et al. 5). Essi possono essere utilizzati fino al 10 ° passaggio, senza cambiamenti notevoli nel comportamento 29. <p class = "jove_title"> 3. Raccolta e dissociazione dei gangli spinali (DRG) Neuroni Terminare il ratto per dislocazione cervicale e decapitazione. Shave ratto e sollevare la pelle per esporre la colonna vertebrale. Utilizzando forbici affilate, durare più dell 'la colonna vertebrale prendendo cura supplementare degli organi ristretti e vasi sanguigni. Trasferire la colonna vertebrale in un armadio di sicurezza biologica (classe II) con una capsula di Petri e rimuovere qualsiasi parte dorsale. Dividere la colonna vertebrale a metà lungo l'asse longitudinale usando forbici chirurgiche sterili e taglienti per esporre il midollo. A questo punto, è utile tagliare la colonna vertebrale in due segmenti più piccoli di sotto del livello della gabbia toracica, per rendere più facile maneggiare durante la raccolta DRG neurone. Utilizzando una pinza sottile, rimuovere delicatamente tutto il tessuto del midollo, facendo attenzione a non tirare e rimuovere le radici DRG. In questo modo il DRG e radici saranno esposti nei canali vertebrali, ancora racchiuso nella colonna. Osservare DRG come bianco filamenti Coming direttamente dai canali. Estrarre l'intera radice DRG (non solo il DRG) dai canali vertebrali utilizzando una pinza molto fini, andando in profondità nei canali vertebrali e facendo attenzione a non danneggiare le radici dei gangli. Trasferire il DRG in una piccola capsula di Petri (60 mm 2) contenente 3-4 ml di mezzo di F12 di Ham integrato con 1% PS. Se si utilizza diversi animali, usare piatti separati. Sotto un microscopio da dissezione, pulire il DRG di ogni eccesso di radici nervose che circondano i gangli con pinza sterile e un bisturi per ridurre la contaminazione delle cellule gliali. Trasferire il DRG in una piccola capsula di Petri (35 mm 2) con 1,8 ml di mezzo F12 fresco. Aggiungere 200 ml di soluzione di peso / v tipo collagenasi IV magazzino 1,25% (concentrazione finale di 0,125%) e incubare il DRG a 37 ° C, 5% CO 2 per 1 ora. Aspirare accuratamente il terreno con una pipetta di vetro, facendo attenzione a non aspirare o danneggiare il DRG. Aggiungere mezzo F12 fresco elasticamented con 0,125% peso / v collagenasi di tipo IV enzima e incubare per 1 ora come descritto precedentemente. Aspirare il medio e lavare delicatamente la DRG con il mezzo F12. Aggiungere quindi 1,8 ml di mezzo F12 e 200 ml di tripsina (concentrazione finale di 0,25% in peso / v) e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 30 min. Rimuovere tripsina e aggiungere 1 ml di terreno F12 integrate con 500 ml di FBS di arrestare la reazione enzimatica. Aspirare il mezzo e lavare delicatamente DRG con mezzo F12 per tre volte per rimuovere tracce di siero. Aggiungere 2 ml di terreno fresco F12 e trasferire accuratamente DRG con il terreno in una provetta da 15 ml usando una pipetta di vetro. Dissociarsi delicatamente i neuroni DRG pipettando su e giù (circa 8-10 volte) con la pipetta di vetro (punte di plastica possono essere utilizzati come alternativa). Lasciare il pellet di stabilirsi nella parte inferiore del tubo e raccogliere il mezzo in una nuova provetta. Aggiungere 2 ml di terreno fresco F12 per il tubo contenente il pellet e ripetere la mdissociazione eccanico con la pipetta di vetro. Ripetere questa operazione fino a quando la sospensione diventa omogenei (circa 3-4 volte) e raccogliere tutte le DRG dissociato nel nuovo tubo. Questo metodo riduce la sollecitazione derivante dalla dissociazione meccanica e migliora la vitalità dei neuroni. Filtrare la sospensione omogeneizzata risultante in un nuovo tubo da 15 ml con un colino micron cella 100 per rimuovere i neuroni non-dissociati e altri detriti. A questo punto, potrebbe essere conveniente per filtrare prima sospensione cellulare in una provetta da 50 ml e poi trasferire la soluzione nel tubo più piccolo utilizzando una pipetta di vetro. Centrifugare la sospensione a 110 g per 5 min. Preparare un siero albumina bovina 15% (BSA) aggiungendo 500 ml di una soluzione di BSA 30% a 500 ml di mezzo F12. Lentamente pipettare la soluzione lungo la parete di un tubo 15 ml per creare un percorso proteine ​​graduale. In questa fase, è utile per tenere il tubo ad un angolo di 45 ° e rilasciare lentamente la BSA utilizzando i numeriil tubo falcon come riferimento per la "pista" formatura. Aspirare il supernatante dal punto 3.10 lasciare 500 microlitri sul fondo della provetta e risospendere il pellet cellulare nello stesso mezzo. Lentamente pipettare la sospensione lungo il sentiero di proteine ​​precedentemente preparato nel passo 3.11 (usare i numeri sul tubo come riferimento) e centrifugare a 500 g per 5 min. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 1 ml di terreno BS modificato (o supporto misto per la ASC / DRG co-coltura SC-like, come descritto di seguito nel passo 4.5. NOTA: Il volume per risospendere le neuroni DRG può essere effettuata a volume effettivo richiesto, a seconda della concentrazione cellulare finale desiderata e il numero di campioni da seminato. Un animale fornirà abbastanza cellule per un esperimento di 24-pozzetti. Incubare i campioni seminati a 37 ° C, 5% CO 2 per 2 ore per permettere l'adesione delle cellule e infine aggiungere mezzo BS fresco supplementato con 50 ng / ml di crescita nervoso factor (NGF). 4. Diretta Co-cultura della SC-come ASC e DRG neuroni Mantenere SC-come ASC in cultura a livello sub-confluenti come descritto al punto 2.2.3. Ventiquattro ore prima della raccolta DRG, aspirare il terreno differenziazione delle cellule staminali e lavare le cellule con HBSS. Aspirare e incubare in 3 ml di tripsina a 37 ° C, 5% CO 2 per 3 min. Controllare al microscopio luce che tutte le cellule sono staccato dal pallone. Battere delicatamente il pallone per aiutare il distacco. Aggiungere 7 ml di mezzo per arrestare la reazione tripsina, raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e centrifugare a 110 g per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di terreno differenziazione delle cellule staminali. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e diluire la sospensione cellulare in base alla concentrazione finale desiderata. Idealmente, seminando 20.000 SC-like ASC / cm 2 garantirebbe uno strato confluente di cellule. Seed il SC-likeASC sul substrato e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 24 ore per permettere l'adesione delle cellule. Dopo 24 ore di incubazione, aspirare il terreno e aggiungere i neuroni DRG sopra le cellule come descritto al punto 3.14 e 3.15. Cambiare medio e un mezzo mista contenente il 50% di cellule staminali terreno di differenziamento e il 50% di BS medie. Inoltre, riducendo la concentrazione di FBS al 1-2,5% nel terreno misto finale contribuisce ad evitare la proliferazione delle cellule satelliti contaminanti derivanti dalla dissociazione DRG. Incubare i campioni co-coltivate a 37 ° C, 5% CO 2 e mantenere in coltura per il tempo necessario per le prove future.