Les ganglions rachidiens neurones et les cellules souches différenciées dérivées de tissu adipeux: Un<em> In Vitro</em> Co-culture modèle pour étudier la régénération des nerfs périphériques

NOTE: Toutes les expériences impliquant des animaux ont été effectuées en conformité avec les animaux au Royaume-Uni (Scientific Procedures) Act, 1986. 1. expérimental Avant de commencer la récolte de tissus et de cellules, vérifier que tous les outils sont stériles. Que nécessaire, autoclave une paire de ciseaux chirurgicaux Sharp, très fines pinces et une pince fine standard. Stériliser également chaque substrat avant l'ensemencement de cellules en utilisant la stérilisation UV, exposition à l'éthanol ou la stérilisation à la vapeur, le cas échéant. Préparation des médias pour la récolte de cellules souches et la différenciation Préparation du milieu de croissance de cellules souches, contenant du milieu essentiel minimum (α-MEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 200 mM de L-glutamine et 1% de pénicilline-streptomycine (PS). Préparer une solution mère 10 mM de forskoline en dissolvant 10 mg de forskoline dans 2,436 ml de sulfoxyde de diméthyle stérile. Utiliser à une concentration finale de 14 uM. </ Li> Préparer une solution à 35 ml mg / stock d'acide rétinoïque en dissolvant 50 mg dans 1,43 ml de sulfoxyde de diméthyle stérile. Utilisation à une concentration finale de 350 ng / ml. Préparer le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) des stocks (100 ug / ml) en dissolvant 10 mg de poudre lyophilisée dans 100 pi d'eau distillée stérile. Utilisation à une concentration finale de 5 ng / ml. Préparer facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) des stocks (100 ug / ml) en dissolvant 50 mg de poudre lyophilisée dans 500 pi d'eau distillée stérile. Utilisation à une concentration finale de 10 ng / ml. Préparation du milieu de différenciation de cellules souches, contenant un milieu de croissance de cellules souches supplémenté avec 14 uM de forskoline, 126 ng / ml croissance gliale facteur-2 (GGF-2), 5 ng / mL dérivé des plaquettes facteur de croissance (PDGF), et 10 ng / ml de facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF). Préparation des médias et des solutions d'achat d'actions pour la récolte des neurones et de la dissociation Préparer Bottenstein et (la BS) de Sato support 28, par addition de 1% de PS et 1% de supplément N2 à du milieu F12 de Ham. Calculer le volume final nécessaire que 500 ul par puits (si vous utilisez une plaque de 24 puits). Préparer les stocks collagénase IV dans du milieu F12 de Ham à une concentration de 1,25% p / v. Filtre-stériliser la solution et conserver à -20 ° C en aliquotes de 200 pi. Préparer stocks de trypsine pancréatique bovine dans le milieu F12 de Ham à la concentration de 2,5% en poids / volume, filtre stériliser et conserver à -20 ° C en 200 aliquotes. Préparer le facteur de croissance des nerfs (NGF) solution mère à la concentration de 5 ug / ml dans un filtre stérilisé 1 mg / ml de sérum albumine bovine sans acide gras (BSA) solution en milieu de F12 et conserver à -20 ° C en 200 pi aliquots. Ne pas faire un filtrage du NGF après reconstitution. Dans le cas où aucune modification de surface a été effectué, des lamelles de couches / plaques de poly-D-lysine (0,1 mg / ml pendant 15 min à température ambiante) Et / ou la laminine (2-10 mg / cm 2 pendant 2 heures à 37 ° C) pour soutenir l'attachement neurone et la croissance des neurites, le cas échéant. Toujours réchauffer médias dans un bain d'eau à 37 ° C avant de l'utiliser. 2. adipeux dérivés de cellules souches (ASC) récolte et de la différenciation dans un phénotype SC la récolte de l'ASC de la graisse viscérale et inguinale des rats mâles adultes Sprague-Dawley Avant de commencer, préparer un tube avec 10 à 15 ml de solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) additionnée de 1% v / v de solution PS et stocker sur de la glace jusqu'à ce que la graisse récolte. Terminer le rat par dislocation cervicale et décapitation. Raser le rat et faire une incision abdominale à travers la peau, exposant ainsi les organes internes et d'éviter les saignements. Retirer la graisse viscérale enfermant l'estomac et les intestins (le plus souvent caractérisés par une consistance grasse jaune) et la graisse qui entoure les testicules inguinale d'un adulte mâle Sprague-Dawley rats. e de transferte graisse dans le tube contenant HBSS sur de la glace. Dans une enceinte de sécurité biologique (classe II) hacher finement la graisse en utilisant une paire de ciseaux et une lame de rasoir stérile jusqu'à consistance bien est atteint et le transférer dans un tube contenant 15 ml de solution à 0,2% de type I de la collagénase poids / v fraîchement préparé stérilisée par filtration sur la journée. Transférer le tube dans un bain-marie à 37 ° C et laisser le tissu adipeux à digérer en présence de l'enzyme pendant 30 minutes-1 heure sous agitation continue. Surveiller étroitement la digestion et se arrête avant que le tissu soit complètement dissocié, ce qui améliorera la viabilité cellulaire et le rendement de la cellule. Tissus Filtre Theun-dissocié par un tamis cellulaire 100 um. REMARQUE: Bonne digestion du tissu entraînera consistance homogène de la graisse, visible par l'œil quand remuant doucement le tube, acquérir une apparence beige. Neutraliser l'enzyme en ajoutant 15 ml de milieu de croissance des cellules souches contenant du sérum bovin foetal à 37 ° C et la centrifugeusesolution à 160 g pendant 10 min afin de recueillir la fraction stroma vasculaire, y compris les cellules souches, à la partie inférieure du tube. A ce stade, le culot peut être remis en suspension dans 1 ml de globules rouges tampon de lyse pour éliminer la contamination de cellules sanguines. Après remise en suspension et de pipetage pendant 1 minute, ajouter 10 ml de milieu de croissance des cellules souches fraîches et centrifuger à 160 g pendant 10 min. Aspirer soigneusement le surnageant du tube, en prenant soin de la pastille cellulaire déposée au fond. Remettre en suspension les cellules dans 10 ml de milieu de croissance des cellules souches, les transférer dans un flacons de 75 cm2 et incuber à 37 ° C, 5% CO 2. Maintenir les cellules aux niveaux sous-confluentes jusqu'au passage 1-2, changer milieu tous les trois jours. différenciation ASC à un phénotype SC Au passage 1-2, éliminer le milieu de croissance de cellules souches à partir de la 75 cm 2 flacon et le remplacer par 10 ml de milieu frais contenant 1 mM β-mercaptoéthanol fraîchement préparouge et stérilisée par filtration sur la journée. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 24 heures. A ce stade, il est important que les cellules sont ensemencées à faible densité (30%) avant de commencer la différenciation. Laver les cellules soigneusement avec du HBSS, aspirer et de le remplacer par 10 ml de milieu contenant 350 ng / ml d'acide rétinoïque. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 72 heures. Essayez de minimiser l'exposition du milieu cellulaire à la lumière. Après trois jours, laver les cellules soigneusement avec du HBSS, aspirer et de le remplacer par 10 ml de souches milieu de différenciation cellulaire (voir l'étape 1.2.6). Maintenir les cellules au niveau sous-confluentes, changer milieu tous les trois jours. NOTE: Après deux semaines d'incubation, ASC sont différenciées en SC-like ASC, exprimant leur phénotype caractéristique (comme démontré par Kingham et al 5.). Ils peuvent ensuite être utilisés jusqu'à la 10e passage, sans changements notables dans le comportement 29. <p class = "jove_title"> 3. Récolte et de dissociation des ganglions rachidiens (DRG) neurones Terminer le rat par dislocation cervicale et décapitation. Rasez le rat et soulever la peau pour exposer la colonne vertébrale. Avec des ciseaux pointus, Excide la colonne vertébrale en prenant soin supplémentaire des organes confinés et les vaisseaux sanguins. Transférer la colonne vertébrale dans une enceinte de sécurité biologique (classe II) en utilisant une boîte de Pétri et de supprimer toute partie dorsale. Diviser la colonne vertébrale en deux le long de l'axe longitudinal avec des ciseaux chirurgicaux stériles et pointus pour exposer le tissu de cordon. À ce stade, il est utile de couper la colonne vertébrale en deux segments plus petits en dessous du niveau de la cage thoracique, pour le rendre plus facile à manipuler pendant la récolte des neurones DRG. En utilisant des pinces fines, retirez délicatement tout le tissu de la moelle, en accordant une attention à ne pas tirer et enlever les racines DRG. De cette façon, le DRG et les racines seront exposés dans les canaux vertébraux, encore enfermé dans la colonne. Observez DRG sous forme de filaments blancs coming directement à partir des canaux. Retirez toute la racine de DRG (pas seulement le DRG) des canaux vertébrales de l'aide de pinces très fines, aller en profondeur dans les canaux vertébrales et de prêter attention à ne pas endommager les racines des ganglions. Transférer le DRG dans une petite boîte de Pétri (60 mm 2) contenant 3-4 ml de milieu F12 de Ham additionné de 1% PS. Si vous utilisez différents animaux, utiliser des plats séparés. Sous un microscope de dissection, nettoyer le DRG de tout excédent de racines nerveuses entourant les ganglions aide de pinces stériles et un scalpel pour réduire la contamination de cellules gliales. Transférer le DRG dans une petite boîte de Pétri (35 mm 2) avec 1,8 ml de milieu F12 frais. Ajouter 200 ul d'une solution p / v collagénase de type IV de valeurs de 1,25% (concentration finale de 0,125%) et incuber le DRG à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 1 heure. Aspirer soigneusement le milieu avec une pipette en verre, en accordant une attention de ne pas aspirer ou endommager la DRG. Ajouter milieu F12 frais soupleen œuvre avec 0,125% p / v de la collagénase de type IV enzyme et incuber pendant 1 heure comme décrit précédemment. Aspirer le milieu et laver délicatement la DRG avec un milieu de F12. Ajouter ensuite 1,8 ml de milieu F12 et 200 pi de trypsine (concentration finale de 0,25% p / v) et incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 30 min. Retirer la trypsine et ajouter 1 ml de milieu F12 supplémenté avec 500 pi de FBS pour arrêter la réaction enzymatique. Aspirer le milieu et laver délicatement la DRG avec un milieu de F12 trois fois pour éliminer les traces de sérum. Ajouter 2 ml de milieu F12 frais et transférer soigneusement le DRG avec le milieu dans un tube de 15 ml en utilisant une pipette en verre. Dissocier doucement les neurones DRG par pipetage de haut en bas (environ 8-10 fois) avec la pipette de verre (embouts en plastique peuvent être utilisés comme solution de rechange). Laisser le pellet se déposer au fond du tube et de recueillir le milieu dans un nouveau tube. Ajouter 2 ml de milieu F12 frais dans le tube contenant le culot et répéter la mdissociation écanique avec la pipette de verre. Répétez cette étape jusqu'à ce que la suspension devienne homogène (environ 3-4 fois) et recueillir toutes les DRG dissocié dans le nouveau tube. Cette méthode réduit la contrainte résultant de la dissociation mécanique et améliore la viabilité des neurones. Filtrer la suspension homogénéisée résultant dans un nouveau tube de 15 ml en utilisant un tamis de 100 um cellulaire pour éliminer les neurones non dissociés et d'autres débris. A ce stade, il peut être commode de premier filtrage de la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml, puis transférer la solution dans le tube plus petit en utilisant une pipette en verre. Centrifuger la suspension à 110 g pendant 5 min. Préparer une sérum-albumine bovine à 15% (BSA) en ajoutant 500 ul d'une solution de BSA à 30% à 500 ul de milieu F12. Pipette lentement la solution le long du mur d'un tube de 15 ml pour créer un sentier de protéines progressive. A ce stade, il est utile de tenir le tube à un angle de 45 ° et relâcher lentement l'BSA en utilisant les numéros surle tube de faucon comme une référence pour la "piste" former. Aspirer le surnageant provenant de l'étape 3.10 laissant 500 pi au fond du tube et remettre en suspension le culot de cellules dans le même milieu. Pipette lentement la suspension le long du sentier de protéine préparée précédemment à l'étape 3.11 (utiliser les numéros sur le tube de référence) et centrifuger à 500 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de milieu de BS modifiée (ou un milieu mixte pour l'ASC / DRG co-culture de SC-like, comme décrit ci-dessous à l'étape 4.5. NOTE: Le volume de remettre en suspension les neurones DRG peut être constitué au volume réel nécessaire, en fonction de la concentration cellulaire finale souhaitée et le nombre d'échantillons à ensemencer. Un animal fournira suffisamment de cellules pour une expérience de plaque de 24 puits. Incuber les échantillons ensemencés à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 2 heures pour permettre la fixation des cellules et enfin ajouter du milieu frais additionné de BS à 50 ng / ml de fa de croissance des nerfscteur (NGF). 4. Direct Co-culture de la SC comme ASC et DRG neurones Maintenir SC-ASC comme dans la culture au niveau sous-confluence comme décrit à l'étape 2.2.3. Vingt-quatre heures avant la récolte de DRG, aspirer le milieu de différenciation de cellules souches et laver les cellules avec HBSS. Aspirer et incuber dans 3 ml de trypsine à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 3 minutes. Arrivée au microscope optique que toutes les cellules sont détachées de la fiole. Tapoter légèrement le ballon pour aider détachement. Ajouter 7 ml de milieu pour interrompre la réaction de la trypsine, de recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml et centrifuger à 110 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de milieu de différenciation de cellules souches. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre et on dilue la suspension de cellules en fonction de la concentration finale requise. Idéalement, l'ensemencement 20 000 SC comme ASC / cm 2 garantirait une couche confluente de cellules. Ensemencer le SC-likeASC sur le substrat et incuber à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 24 heures pour permettre la fixation des cellules. Après 24 heures d'incubation, aspirer le milieu et ajouter les neurones de DRG au-dessus des cellules comme décrit dans l'étape 3,14 et 3,15. Changer le milieu à un milieu mixte contenant 50% de milieu de différenciation de cellules souches et 50% de milieu BS. En outre, la réduction de la concentration de FBS à 1-2,5% dans le milieu mixte finale permet d'éviter la prolifération de contaminer les cellules satellites provenant de la dissociation de DRG. Incuber les échantillons de co-culture à 37 ° C, 5% CO 2 et de maintenir en culture pendant le temps nécessaire pour les essais futurs.