根神経節ニューロンと差別化された脂肪由来幹細胞を背：<em>インビトロ</em末梢神経再生を研究するために>共培養モデル

注記：動物を含むすべての実験は、英国動物（科学的処置）法1986に従って実施した。 1.実験の設定組織および細胞収穫を開始する前に、すべてのツールが無菌であることを確認してください。必要かどうかは、鋭い外科はさみ、非常に細かい鉗子と細かい標準鉗子のペアをオートクレーブ。また、UV殺菌、エタノール曝露または必要に応じて蒸気滅菌を用いた細胞播種前に、各基材を滅菌する。 幹細胞の採取および分化のための培地の調製 10％ウシ胎児血清（FBS）、200 mM L-グルタミン、および1％ペニシリン-ストレプトマイシン（PS）を補充した最小必須培地（α-MEM）を含む、 幹細胞増殖培地を準備する。 無菌ジメチルスルホキシドの2.436ミリリットルでフォルスコリン10mgを溶解することによってフォルスコリンの10 mMストック溶液を調製する。 14μMの最終濃度で使用してください。</ LI> 無菌ジメチルスルホキシドの1.43ミリリットルで50ミリグラムを溶解することにより、レチノイン酸の35 mg / mlのストック溶液を準備します。 350 NG / mlの最終濃度で使用してください。 滅菌蒸留水100μl中の凍結乾燥粉末を10μgを溶解させることにより、血小板由来増殖因子（PDGF）ストック（100μg/ ml）を調製する。 5 ngの/ mlの最終濃度で使用してください。 滅菌蒸留水500μlの凍結乾燥粉末を50μgを溶解させることにより、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）ストック（100μg/ ml）を調製する。 10ng / mlの最終濃度で使用してください。 14μMフォルスコリン、126 / mlのグリア成長因子-2（GGF-2）、5 ng / mLでの血小板由来増殖因子（PDGF）、および10ng /補充した幹細胞増殖培地を含む、 幹細胞分化培地を調製mlの塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）。 ニューロン収穫および解離のためのメディアとストック溶液の調製 Bottenstを準備HamのF12培地に1％PS、1％N2サプリメントを添加することにより、28アインと佐藤（BS）培地。ウェルあたり500μlのように必要な最終容量を計算する（24ウェルプレートを使用している場合）。 重量/ V 1.25％の濃度でハムF12培地中でコラゲナーゼIVストックを準備します。 200μlのアリコートとして-20℃で溶液とストアをフィルター滅菌する。 、2.5％重量/ Vの濃度でハムF12培地にウシ膵臓トリプシンの株式を準備し、200μlのアリコートとして-20℃でフィルター滅菌とストア。 200μlのような-20℃でのF12培地とストア内のフィルター滅菌し、1mg / mlの脂肪酸不含ウシ血清アルブミン（BSA）溶液中に5μg/ mLの濃度で神経成長因子（NGF）ストック溶液を調製しアリコート。再構成後NGFをフィルタリングしないでください。 ケースでない表面改質をRTで15分間、コートカバーガラス/ポリ-D-リジンプレート（0.1 mg / mlの行われていない）及び/又はラミニン（37°Cで2時間2-10μgの/ cm 2）を適切なニューロン結合および神経突起伸長をサポートする。 常に使用前に37℃の水浴中でメディアを温める。 2.脂肪由来幹細胞（ASC）の収穫と分化のSC表現型へ大人の雄Sprague-Dawleyラットの内臓と鼠径脂肪からASCの収穫開始ハンクス平衡食塩溶液脂肪収穫まで氷上でPS溶液およびストアの1％v / vのを補充した（HBSS）10~15 mlのチューブを準備する前に。 頸椎脱臼と断頭によりラットを終了します。内臓を露出させ、出血を避け、ラッ​​トを剃ると腹部の皮膚を介して切開する。胃と腸（通常は脂肪黄色一貫性を特徴とする）と大人の雄Sprague-Dawley系ラットから睾丸を囲む鼠径部脂肪を包む内臓脂肪を除去します。転送番目氷上でHBSSを含むチューブ内の電子脂肪。 微細な稠度に達するまで、生物学的安全キャビネット（クラスII）に細かくハサミおよ​​び滅菌カミソリの刃を使用して脂肪を切ると、新たに調製した0.2％重量/容量型コラゲナーゼI溶液15mlを含むチューブにそれを転送し濾過滅菌の日に。 37℃の水浴中でチューブを移し、連続撹拌下で30分〜1時間、酵素の存在下で消化する脂肪組織を残す。密接に消化を監視し、組織が完全に解離する前に停止し、これは、細胞生存率および細胞収率を改善する。 100μmのセルストレーナーを通してフィルタ·トゥン·解離した組織。 注：優しくチューブを渦巻く時グッド組織消化はベージュの外観を取得し、目で見える、脂肪の均質な一貫性になります。 幹細胞増殖の37℃でのウシ胎児血清を含む培地と遠心15mlを添加することによって酵素を中和10分間、160グラムの溶液をチューブの底に、幹細胞を含む間質血管画分を収集するためである。 この段階では、ペレットは、赤血球1 mlに再懸濁させることができる血液細胞の混入を除去するための溶解緩衝液。 1分間再懸濁し、ピペッティングした後、10分間、160×gで、新鮮な幹細胞増殖培地および遠心分離機を10ml加える。 慎重に底に堆積した細胞ペレットの世話をして、チューブから上清を吸引除去する。 、幹細胞成長培地10ml中で細胞を再懸濁し75cm 2のフラスコ中にそれらを転送し、37℃、5％CO 2でインキュベートする。 3日ごとに培地を交換、流路1-2までサブコンフルエントレベルで細胞を維持する。 SC表現型への分化ASC 継代1~2において、75cm 2のフラスコからの幹細胞増殖培地を除去し、prepa新たに1mMのβメルカプトエタノールを含有する新鮮な培地10mlに置き換える赤と日にフィ​​ルター滅菌。 24時間、37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートする。この段階では、細胞が分化を開始する前に、低密度（30％）で播種することが重要である。 慎重にHBSS、吸引で細胞を洗浄し、350 / mlのレチノイン酸を含む培地10mlと交換してください。 72時間37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートする。光への細胞中の露出を最小限に抑えるようにしてください。 3日後、HBSSで丁寧に細胞を洗浄、吸引と（ステップ1.2.6を参照）、幹細胞分化培地10mlと交換してください。 3日ごとに培地を交換、サブコンフルエントレベルで細胞を維持する。 注：（。キンガムら 5によって示されるように）インキュベーションの2週間後に、ASCは、それらの特徴的な表現型を発現する、SC-様ASCに分化している。次いで、これらの行動29の顕著な変化なしに10回継代まで使用することができる。 <Pクラス= "jove_title"> 3。後根神経節（DRG）ニューロンの収穫と解離頸椎脱臼と断頭によりラットを終了します。ラットを剃ると脊柱を露出するために皮膚を持ち上げる。鋭いハサミを使用して、閉じ込められた臓器や血管の余分な世話をして脊柱をexcide。ペトリ皿を使用して生物学的安全キャビネット（クラスII）で脊柱を移し、すべての背の部分を削除します。 臍帯組織を露出させるために、滅菌鋭い外科用ハサミを使用して、長手方向軸に沿って半分に脊柱を分割する。この時点で、それが簡単にDRGニューロンの収穫時に処理するようにするために、胸郭のレベル以下の2小さなセグメントに脊柱をカット​​すると便利です。細かい鉗子を使用して、静かにDRGの根を引き、削除しないように注意を払って、すべてのコードの組織を除去する。 DRGと根が椎骨の運河内に露出されます。このようにして、まだ列に包まれた。白いフィラメントコミとしてDRGを観察運河から直接ngの。 、非常に微細な鉗子を使用して深いの椎運河に入ると神経節の根を傷つけないように注意を払うことで、椎運河から全体のDRGルート（だけでなく、DRG）を引き出します。 1％のPSを補足したハムF12培地3-4 mlを含む小さなペトリ皿（60ミリメートル2）にDRGを転送します。異なる動物を用いた場合は、別々の皿を使用しています。 解剖顕微鏡下で、グリア細胞の混入を低減するために滅菌ピンセットとメスを用いて神経節周囲の神経根の余分のDRGをきれい。新鮮なF12培地の1.8ミリリットルの小さなペトリ皿（35ミリメートル2）にDRGを転送します。 1.25％重量/体積のコラゲナーゼIV型ストック溶液（0.125％の最終濃度）を200μl添加し、1時間37℃、5％CO 2でDRGをインキュベートする。慎重にDRGを吸引か傷つけないように注意を払って、ガラスピペットで培地を吸引除去する。しなやかな新鮮なF12培地を追加します。前述のように0.125％重量/体積のコラゲナーゼIV型酵素とmentedと1時間インキュベートする。 メディアを吸引し、軽くF12培地でDRGを洗う。その後、F12培地1.8 mlを加え、トリプシン（0.25％重量/体積の最終濃度）を200μlと30分間37℃、5％CO 2でインキュベートする。 トリプシンを除去し、酵素反応を停止させるために、FBSの500μlの補充したF12培地の1ミリリットルを追加します。メディアを吸引し、軽く血清の痕跡を除去する3回F12培地でDRGを洗う。 新鮮なF12培地2mlを追加し、慎重にガラスピペットを用いて、15​​ミリリットルチューブに培地でDRGを転送する。静かに（プラスチックチップが代替として使用することができます）をガラスピペットでピペッティング（約8〜10倍）でDRGニューロンを解離。 ペレットがチューブの底に沈降し、新しいチューブに培地を収集できる。ペレットを含むチューブに新鮮なF12培地2mlを追加し、Mを繰り返すガラスピペットでechanical解離。懸濁液が均一になるまで、この手順を繰り返し（約3〜4倍）と新しい​​チューブ内の全ての解離DRGを収集します。この方法は、機械的解離に由来する応力を低減し、神経細胞の生存率を向上させる。 未解離したニューロンと他の破片を除去するために100μmのセルストレーナーを使用して、新しい15ミリリットルチューブに生じた均質化されたサスペンションをフィルタリングします。この段階では、最初の50 mlチューブに細胞懸濁液をフィルタリングした後、ガラスピペットを用いて、小さなチューブに溶液を転送するために便利かもしれない。 5分間110グラムでサスペンションを遠心。 F12培地を500μlの30％BSA溶液500μlを加えることにより、15％のウシ血清アルブミン（BSA）を調製する。ゆっくりと段階的なタンパク質証跡を作成するために15ミリリットルチューブの壁ダウンソリューションをピペット。この段階では、45°の角度でチューブを保持し、ゆっくりと数字を使用して、BSAを放出することが有用である形成「トラック」の基準とファルコンチューブ。 チューブの底に500μlのを残すステップ3.10からの上清を吸引し、同じ培地で細胞ペレットを再懸濁します。ゆっくりと前に5分間、500gでステップ3.11（基準となるチューブに番号を使用）し、遠心機で調製したタンパク質道に沿ってサスペンションをピペット。 ステップ4.5で、以下に説明するように、上清を吸引除去し、修正されたBS媒体（またはSC-様ASC / DRG共培養のための混合媒体の1ミリリットル中にペレットを再懸濁。 NOTE：DRGニューロンを再懸濁するためにボリュームを播種するために所望の最終細胞濃度とサンプル数に応じて、実際に必要な容積にすることができる。 1匹の動物が、24ウェルプレートの実験のために十分な細胞を提供する。 細胞接着を可能にするために2時間37℃、5％CO 2で播種し、サンプルをインキュベートし、最終的に神経成長faを50 ng / mlを補充した新鮮なBS培地を追加ctorの（NGF）。 4. SC-様ASCの直接共培養し、DRGニューロンステップ2.2.3で説明したように、サブコンフルエントレベルでの培養でのSC-様ASCを維持します。 DRGの収穫の前に二十四時間、幹細胞分化培地を吸引し、HBSSで細胞を洗浄する。吸引し、3分間37℃、5％CO 2でトリプシン3ml中でインキュベートする。 すべての細胞がフラスコから分離した光顕微鏡下で確認してください。静かに剥離を助けるために、フラスコをタップします。 5分間、110×gで15mlチューブと遠心分離機で細胞懸濁液を回収し、トリプシン反応を停止させる培地7mlのを追加する。 上清を吸引し、幹細胞分化培地5ml中に細胞ペレットを再懸濁する。血球計数器を用いて細胞をカウントし、必要な最終濃度に応じて、細胞懸濁液を希釈する。理想的には20,000 SC-様ASCを播種/ cm 2の細胞の融合層を保証する。 SC-様をシード基板上のASCおよび細胞接着を可能にするために24時間37℃、5％CO 2でインキュベートする。 24時間のインキュベーション後、培地を吸引し、ステップ3.14及び3.15に記載されているように、細胞の上にDRGニューロンを追加する。幹細胞分化培地の50％、BS培地の50％を含有する混合培地に培地を変える。また、最終的な混合媒体中で1から2.5パーセントのFBS濃度を低減することDRG解離から誘導衛星細胞を汚染するの増殖を回避することに役立つ。 37℃、5％CO 2で共培養したサンプルをインキュベートし、将来のテストのために必要な時間培養において維持する。