JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

גב שורש הגרעינים עצב ותאי גזע שמקורם בשומן Differentiated:<em> במבחנה</em> משותף תרבות דגם לחקר התחדשות של עצבים היקפיים

Published: February 26, 2015
doi:
10.3791/52543
, ,
1Centre for Neuroprosthesis,EPFL | STI | IMT/IBI | LSBI, 2Blond McIndoe Research Laboratories, Institute of Inflammation & Repair,The University of Manchester, 3University Hospital of South Manchester

Summary

גרעיני גב שורש (DRG) הם מבנים המכילים את תאי העצב התחושתיים של מערכת עצבים ההיקפית. כאשר ניתק, הם יכולים להיות שיתוף תרבותי עם תאים כמו SC-המופק שומן גזע (ASC), מתן מודל רב ערך כדי ללמוד במבחנה התחדשות עצב וmyelination, מחקה את סביבת in vivo באתר הפציעה.

Abstract

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Introduction

פציעות עצבים היקפיים נפוצות עם כ -9,000 מקרים בבריטניה המתרחשים בכל שנה בעיקרה צעיר ואוכלוסייה עובד 1. למרות טכניקות תיקון עצב מייקרו, שיקום רגיל של פונקציה הוא בלתי ניתן להשגה עם תוצאת יד תחושה לקויה, תפקוד מוטורי מופחת וכאב תכוף וחוסר סובלנות קרה 2. יש להם פציעות כגון השפעה עמוקה וקבועה על המטופל ועל יכולתן לבצע פעולות יומיומיות, עם פחות מ -60% חוזרים לעבודה 3.

בעקבות פציעה, פנוטיפ והמורפולוגיה של תאי עצב ותאי שוואן שינוי (SC) על מנת ליצור סביבה מתאימה שתאפשר נביטת האקסון. במקרה של חיתוך רוחב, העצב מחולק להפרוקסימלי וגדמי דיסטלי; להיות הנקודה שממנה את תהליך ההתחדשות מתרחש, תוך הגדם הדיסטלי הגדם הפרוקסימלי עובר ניוון Wallerian ואז ניתק SCמהאקסונים נפצעו, דה-להבדיל ולהתרבות. זה הוא יסוד לכיוון הסרת המיאלין פסולת והכנת הגדם הדיסטלי ל4,5 מחדש דור עצב. ההנבטה אקסון נתמכת על ידי הייצור של גורמי neurotrophic וכמוקינים שפורסמו על ידי SC בגדם הדיסטלי, ומונחה על ידי lamina הבסיס נשאר מאחור הבא ניוון Wallerian 6,7. SC ליישר לצד האקסון ההתחדשות להרכיב הלהקות של Büngner, אשר מסייע צמיחת האקסון לאיבר המטרה, הפחתת ההסתעפות מחוץ לצינור endoneurial. בעקבות reinnervation, SC מהווה את מעטפת המיאלין החדשה עוטפת את האקסונים מחדש, אבל תפקוד חושי ומוטורי הוא רק החזיר 8 באופן חלקי.

גרעיני שורש הגבי (DRG) הם מבנים הממוקמים בforamina חולייתי בעמוד השדרה, המכילים את התאים עצביים התחושתיים innervating האיברים ההיקפיים. כאשר ניתק, הם יכולים לשמש כמתאימים במבחנה modאל לחקר התחדשות עצב 9-11, כוללים חקירות של היווצרות המיאלין. בפרט, הנוירונים DRG המבוגרים לחקות את מאפייני in vivo של תאים אלה ולספק כלי אימתני ללמוד אסטרטגיות חדשות לתיקון עצב היקפי בהנדסת רקמות.

שיתוף תרבויות מייצגות מערכת דינמית המדמה במבחנה הגומלין של שני (או יותר) סוגי תאים בסביבה מסוימת in vivo. אחד היתרונות של דגמי שיתוף תרבות תאים אלה הוא הגמישות ושליטה גבוהה שיכול להיות שהופעלה על הסביבה תאית. הנוירונים DRG היו בשימוש לעתים קרובות במערכות שיתוף תרבות עם SC לחקות את האינטראקציות המתרחשות בפועל בין שני סוגי התאים במערכת העצבים ההיקפית 10,12 – 14. זה היה הראה כי SC להפריש מטריצה ​​תאית (ECM) חלבונים וגורמי גדילה שיכולה לשפר פלאיםהיכולת של נוירונים DRG לשרוד ולנבוט neurites 15,16. עם זאת, SC דורש תקופות ארוכות של זמן להתרבות ו, למרות ההתקדמות בטכניקת תרבית תאים, זה עדיין קשה כדי ליצור מספר מתאים של תאים עבור יישומי הנדסת רקמות. בנוסף, את ההקרבה של עצב בריא מתחייבת למסוק SC אוטולוגי. לכן, ההבדל בSC המקור חשוב לשניהם הנדסת הרקמות ובבדיקת מבחנה של תאי עצב חדש. בתצוגה זו, ASC יכול להיחשב חלופה רבת ערך לפיתוח מבנה רקמות מהונדסות כדי לשמש ל17,18 תיקון עצב ההיקפי. עבודה קודמת הוכיחה את יכולתם של התאים להתמיין לASC כמו SC-, להביע גליה-סמנים אופייניים, כגון S-100, p75 וחלבון חומצי גליה fibrillary (GFAP) 19, כמו גם את חלבון המיאלין אפס (P0) 20 . הפרשת גורמי גדילת גליה, כגון גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF), גורם גדילה עצבית (NGF) וגורם שמקורן בתאים גליה neurotrophic (GDNF) נצפו גם 21,22. לכן, ASC כמו SC-יכול לשמש כאמרגן של התחדשות עצבים היקפית, כפי שהודגם על ידי שני במבחנת in vivo לומד 23-26. בנוסף, ניתן לקצור ASC באמצעות הליכים מינימאלי פולשנית במספר גבוה יותר בהשוואה לסוגים אחרים של תאי גזע; התדירות של תאי גזע ברקמת שומן היא 100 עד 1,000 גבוה פי יותר מאשר במח עצם 27, ויש להם שיעור ריבוי גבוה יותר בהשוואה לתאי גזע mesenchymal SC ומח עצם.

עבודה זו נועדה לספק פרוטוקול מפורט לביצוע קציר יעיל גבוה של נוירונים DRG ניתקו וASC בהתאמה, האחרון שהבדיל לתוך תאים כמו SC-. התרבות המשותפת של שני סוגי התאים ולכן תספק מערכת מעשית מאוד שיכול לשמש למחקרים עתידיים ביכולת של ne DRGurons לנבוט neurites והמנגנונים של היווצרות המיאלין על פיגום שונה להנדסת רקמות עצבים.

Protocol

הערה: כל הניסויים הכוללים בעלי חיים בוצעו בהתאם לבעלי חיים בבריטניה (הליכים מדעיים) Act, 1986. 1. ניסיוני Set-up לפני תחילת קציר רקמות ותאים, לבדוק שכל הכלים סטריליים. אם יש צורך, חיטוי זוג מספריים חדים כירורגית, מלקחיים עדינים מאוד ומלקחיים סטנדרטיים בסדר. גם לעקר כל מצע לפני זריעת תאים באמצעות עיקור UV, חשיפת אתנול או חיטוי באמצעות קיטור כמתאים. הכנת מדיה לקציר תאי גזע ובידול הכן את מדיום הגידול של תאי גזע, המכיל בינוני מינימום הכרחי (α-ממ) בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS), L-גלוטמין 200 מ"מ, ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין (PS). הכן פתרון מניות מ"מ 10 של forskolin ידי המסת 10 מ"ג של forskolin ב2.436 מיליליטר של sulfoxyde דימתיל סטרילי. השתמש בריכוז סופי של 14 מיקרומטר. </ Li> הכן 35 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות של חומצה רטינואית על ידי המסת 50 מ"ג ב1.43 מיליליטר של sulfoxyde דימתיל סטרילי. השתמש בריכוז סופי של 350 ng / ml. הכן גורם גדילת platelet-derived (PDGF) מניות (100 מיקרוגרם / מיליליטר) על ידי המסת 10 מיקרוגרם של אבקת lyophilized במים סטריליים מזוקקים 100 μl. השתמש בריכוז סופי של 5 ng / ml. הכן גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF) מניות (100 מיקרוגרם / מיליליטר) על ידי המסת 50 מיקרוגרם של אבקת lyophilized ב 500 μl של מים סטריליים מזוקקים. השתמש בריכוז סופי של 10 ng / ml. הכן את מדיום התמיינות תאי גזע, המכיל מדיום גידול של תאי גזע בתוספת 14 מיקרומטר forskolin, 126 ng / צמיחת גליה גורם-2 (GGF-2), 5 ng / ml גורם מ"ל platelet-derived צמיחה (PDGF), ו- 10 ng / גורם מיליליטר בסיסי צמיחת פיברובלסטים (bFGF). הכנה של תקשורת ופתרונות מניות לקציר נוירון ודיסוציאציה הכן Bottenstעין ושל סאטו (BS) 28 בינוניים, על ידי הוספת PS 1% לבין 1% תוספת N2 למדיום F12 של בשר חזיר. חשב את הנפח הסופי הדרוש 500 μl לכל גם (אם משתמש בצלחת 24 גם). הכן מניות IV collagenase במדיום F12 של בשר חזיר בריכוז של 1.25% wt / v. מסנן לעקר את הפתרון ולאחסן ב -20 ° C עד 200 aliquots μl. הכן מניות טריפסין לבלב שור במדיום F12 של בשר חזיר בריכוז של 2.5% wt / v, המסנן-לעקר ולאחסן ב -20 ° C עד 200 aliquots μl. הכן את גורם הגדילה העצבית פתרון מניות בריכוז של 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​במ"ג מעוקר מסנן 1 אלבומין בסרום שור מיליליטר שומן נטול חומצת פתרון / (BSA) במדיום F12 וחנות ב -20 C 200 μl (NGF) aliquots. אל תסנן NGF לאחר הכינון מחדש. במקרה שאין שינוי פני השטח שבוצע, coverslips מעיל / צלחות עם פולי-D ליזין (0.1 מ"ג / מיליליטר במשך 15 דקות ב RT) ו / או laminin (2-10 מיקרוגרם / 2 סנטימטר לשעה 2 ב 37 ° C) כדי לתמוך בקובץ מצורף נוירון ותוצאת neurite כמתאים. תמיד לחמם את התקשורת באמבט מים ב 37 ° C לפני השימוש. 2. תאי גזע שמקורם בשומן קציר (ASC) ובידול להפנוטיפ SC קציר ASC משומן קרביים ומפשעה של חולדות Sprague-Dawley זכר הבוגר לפני להתחיל, להכין צינור עם 10-15 מיליליטר של תמיסת המלח מאוזנת "הנקס (HBSS) השלים עם 1% v / v של פתרון PS וחנות על קרח עד קצירת שומן. לסיים את החולדה על ידי נקע בצוואר רחם ועריפת ראש. לגלח את העכברוש ועושה חתך דרך עור הבטן, חושף את האיברים הפנימיים והימנעות דימום. הסר את השומן הקרביים עוטף את הקיבה ומעיים (בדרך כלל מתאפיין בעקביות צהובה שומנית) ושומן מפשעתי מקיף את האשכים מעכברוש Sprague-Dawley זכר בוגר. העברת השומן דואר בצינור המכיל HBSS על קרח. בארון בטיחות ביולוגי (בכיתה ב ') קוצצים דק את השומן באמצעות מספריים וסכין גילוח סטרילי עד עקביות בסדר הוא הגיע ולהעביר אותו לתוך צינור המכיל 15 מיליליטר של 0.2% wt / v פתרון סוג collagenase מוכן טרי ו לסנן-מעוקר ביום. העבר את הצינור באמבט מים ב 37 ° C ולהשאיר את רקמת השומן לעיכול בנוכחות של האנזים במשך 30 שעות דקות-1 תחת תסיסה מתמדת. לפקח באופן הדוק העיכול ולעצור לפני הרקמה מנותקת לחלוטין, זה ישפר את כדאיות תא ותשואת תא. מסנן theun-ניתק רקמת דרך מסננת תא 100 מיקרומטר. הערה: עיכול רקמה טוב יגרום עקביות הומוגנית של השומן, גלוי על ידי העין כאשר בעדינות מתערבל הצינור, רכישת מראה בצבע בז '. לנטרל את האנזים על ידי הוספת 15 מיליליטר של מדיום גידול של תאי גזע המכיל סרום שור עוברי על 37 מעלות צלזיוס ו צנטריפוגותפתרון של 160 גרם במשך 10 דקות כדי לאסוף את החלק היחסי של כלי דם סטרומה, כוללים תאי הגזע, בחלק התחתון של הצינור. בשלב זה, גלולה ניתן resuspended ב 1 מיליליטר של תאי דם אדומים תמוגה חיץ כדי להסיר זיהום תאי דם. לאחר resuspension וpipetting דקות 1, להוסיף 10 מיליליטר של מדיום גידול של תאי גזע טרי וצנטריפוגות ב 160 גרם במשך 10 דקות. בזהירות לשאוב supernatant מהצינור, טיפול בתא גלולה שהופקד בתחתית. Resuspend תאי 10 מיליליטר של מדיום גידול של תאי גזע, להעביר אותם לתוך סנטימטרים 75 2 צלוחיות ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לשמור על התאים ברמות תת-המחוברות עד מעבר 1-2, שינוי בינוני כל 3 ימים. בידול ASC לפנוטיפ SC במעבר 1-2, להסיר את מדיום הגידול של תאי גזע מהבקבוק 2 75 סנטימטר ולהחליף אותו עם 10 מיליליטר של מדיום טרי המכיל 1 מ"מ β-mercaptoethanol הטרי prepaמעוקר מסנן אדום וביום. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 שעות. בשלב זה, חשוב שהתאים הם זורעים בצפיפות נמוכה (30%) לפני שמתחילים את הבידול. לשטוף את התאים בזהירות עם HBSS, לשאוב ולהחליף אותו עם 10 מיליליטר של מדיום המכיל 350 ng / ml חומצה רטינואית. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 72 שעות. נסה לצמצם את החשיפה של מדיום סלולארי לאור. אחרי 3 ימים, לשטוף את התאים בזהירות עם HBSS, לשאוב ולהחליף אותו עם 10 מיליליטר של מדיום התמיינות תאי גזע (ראה שלב 1.2.6). לשמור על התאים ברמות תת-המחוברות, שינוי בינוני כל 3 ימים. הערה: בעקבות 2 שבועות של דגירה, ASC נבדל לASC כמו SC-, להביע פנוטיפ האופייני שלהם (כפי שהודגם על ידי et al Kingham 5.). הם לאחר מכן ניתן להשתמש עד המעבר -10 ללא שינויים בולטים בהתנהגות 29. <class = "jove_title" p> 3. קציר ודיסוציאציה של הגבי שורש הגרעינים נוירונים (DRG) לסיים את החולדה על ידי נקע בצוואר רחם ועריפת ראש. לגלח את העכברוש ולהרים את העור כדי לחשוף את עמוד השדרה. בעזרת מספריים חדים, excide עמוד השדרה טיפול נוסף של האיברים מוגבלים וכלי דם. העבר את עמוד השדרה בארון ביולוגי בטיחות (בכיתה ב ') באמצעות צלחת פטרי ולהסיר כל חלק הגבי. מחלקים את עמוד השדרה במחצית לאורך ציר האורך באמצעות מספריים ניתוח סטרילי וחדים כדי לחשוף את רקמת החוט. בשלב זה, כדאי לחתוך את עמוד השדרה בשני מקטעים קטנים יותר מתחת לרמה של כלוב הצלעות, כדי לעשות את זה קל יותר לטפל בעונת מסיק נוירון DRG. באמצעות מלקחיים עדינים, בעדינות להסיר את כל רקמת החוט, לשים לב שלא למשוך ולהסיר את שורשי DRG. בדרך זו DRG והשורשים יהיו חשופות בתוך תעלות השדרה, עדיין עטופה בעמודה. שים לב DRG כcomi חוטים לבןng ישירות מהתעלות. משוך את שורש כל DRG (לא רק DRG) מתעלות השדרה באמצעות מלקחיים יפים מאוד, הולכים עמוק לתוך תעלות השדרה ולשים לב שלא לפגוע בשורשים של הגרעינים. העבר את DRG לתוך צלחת פטרי קטנה (60 מ"מ 2) המכילה 3-4 מיליליטר של מדיום F12 של בשר חזיר בתוספת PS 1%. אם אתם משתמשים בבעלי חיים שונים, להשתמש בכלים נפרדים. תחת מיקרוסקופ לנתח, לנקות את DRG של כל עודף של שורשי עצבים המקיפים את הגרעינים באמצעות מלקחיים סטרילית ואזמל להפחתת זיהום תא גליה. העבר את DRG לפטרי צלחת קטנה (35 מ"מ 2) עם 1.8 מיליליטר של מדיום F12 הטרי. הוסף 200 μl של 1.25% מניות פתרון IV סוג collagenase wt / v (ריכוז סופי של 0.125%) ודגירת DRG על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור שעה 1. בזהירות לשאוב בינוני עם טפטפת זכוכית, לשים לב שלא לשאוב או נזק DRG. הוסף בינוני F12 טרי גמישmented עם 0.125% אנזים מסוג IV collagenase wt / v ודגירה עבור שעה 1 כפי שתואר לעיל. לשאוב את המדיום ולשטוף בעדינות עם DRG בינוני F12. להוסיף לאחר מכן 1.8 מיליליטר של מדיום F12 ו -200 μl של טריפסין (ריכוז סופי של 0.25% wt / v) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 30 דקות. הסר טריפסין ולהוסיף 1 מיליליטר של מדיום F12 בתוספת 500 μl של FBS לעצור תגובה האנזימטית. לשאוב את המדיום ולשטוף בעדינות עם DRG בינוני F12 לשלוש פעמים כדי להסיר עקבות של סרום. הוסף 2 מיליליטר של מדיום F12 הטרי ולהעביר בזהירות DRG עם המדיום לתוך צינור 15 מיליליטר בעזרת פיפטה זכוכית. בעדינות לנתק את הנוירונים DRG על ידי pipetting למעלה ולמטה (כ 8-10 פעמים) עם פיפטה הזכוכית (טיפים פלסטיק יכולים לשמש כחלופה). לאפשר לגלולה להתיישב בחלק התחתון של הצינור ולאסוף הבינוני בצינור חדש. הוסף 2 מיליליטר של מדיום F12 הטרי לצינור המכיל את גלולה וחזור מ 'ניתוק echanical עם פיפטה הזכוכית. חזור על פעולה זו עד להשעיה הופכת (כ 3-4 פעמים) הומוגנית ולאסוף את כל DRG ניתק בצינור החדש. שיטה זו מקטינה את הלחץ הנובע מהניתוק המכני ומשפרת את יכולת הקיום של תאי העצב. סנן את ההשעיה הומוגני וכתוצאה מכך לתוך צינור 15 מיליליטר חדש באמצעות מסננת מיקרומטר תא 100 כדי להסיר תאי עצב ניתק-un ופסולת אחרת. בשלב זה, זה יכול להיות נוח לראשון לסנן את ההשעיה התא לתוך צינור 50 מ"ל ולאחר מכן להעביר את הפתרון לתוך הצינור הקטן יותר בעזרת פיפטה זכוכית. צנטריפוגה ההשעיה ב 110 גרם במשך 5 דקות. הכן 15% אלבומין בסרום שור (BSA) על ידי הוספת 500 μl של פתרון BSA 30% עד 500 μl של מדיום F12. לאט לאט פיפטה הפתרון במורד הקיר של צינור 15 מיליליטר כדי ליצור שובל חלבון הדרגתי. בשלב זה, כדאי להחזיק את הצינור בזווית של 45 מעלות ולאט לאט לשחרר את BSA באמצעות המספרים בהצינור בז כהתייחסות ל" מסלול "יוצרים. לשאוב supernatant משלב 3.10 עוזב 500 μl בחלק התחתון של הצינור וresuspend התא גלולה באותו המדיום. לאט לאט פיפטה ההשעיה לאורך שביל החלבון שהוכן קודם לכן בשלב 3.11 (השתמש במספרים בצינור כהפניה) ו צנטריפוגות ב 500 גרם במשך 5 דקות. לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מיליליטר של מדיום שונה BS (או בינוני מעורבת לASC / שיתוף תרבות DRG כמו SC-, כפי שיתואר להלן בשלב 4.5. הערה: הנפח מחדש להשעות את הנוירונים DRG יכול להתבצע עד הנפח בפועל נדרש, בהתאם לריכוז הסופי התא הרצוי ומספר הדגימות שנזרע. חיה אחת תספק מספיק תאים לניסוי צלחת 24 גם. דגירה דגימות זרע על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור שעה 2 כדי לאפשר מצורף תא ולבסוף מוסיף בינוני BS טרי בתוספת / מיליליטר 50 ng של fa גדילה העצביתctor (NGF). 4. הישיר Co-תרבות של ASC כמו SC-וDRG נוירונים לשמור על ASC כמו SC-בתרבות ברמות תת-המחוברות כמתואר בשלב 2.2.3. עשרים וארבע שעות לפני קציר DRG, לשאוב את מדיום התמיינות תאי גזע ולשטוף את התאים עם HBSS. לשאוב ודגירה ב 3 מיליליטר של טריפסין על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 3 דקות. בדוק תחת מיקרוסקופ אור שכל התאים יש מנותקות מהבקבוק. לטפוח בעדינות את הבקבוק כדי לעזור ניתוק. להוסיף 7 מיליליטר של מדיום כדי לעצור את תגובת טריפסין, לאסוף את ההשעיה תא צינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 110 גרם במשך 5 דקות. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 5 מיליליטר של מדיום התמיינות תאי גזע. ספירת התאים באמצעות hemocytometer ולדלל את ההשעיה התא לפי הריכוז הסופי הנדרש. באופן אידיאלי, זריעת 20,000 ASC כמו SC-/ 2 סנטימטר יבטיח שכבה ומחוברות של תאים. זרעים כמו-SCASC על המצע ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 שעות כדי לאפשר מצורף תא. אחרי 24 שעות דגירה, לשאוב את המדיום ולהוסיף את הנוירונים DRG על גבי התאים כמתואר בשלב 3.14 3.15. לשנות את המדיום למדיום מעורב המכיל 50% של מדיום התמיינות תאי גזע ו -50% של מדיום BS. בנוסף, הפחתת ריכוז FBS ל1-2.5% בטווח הבינוני המעורב הסופי מסייעת הימנעות ההתפשטות של זיהום תאי לווין נגזרים מניתוק DRG. דגירה דגימות שיתוף תרבותי על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולשמור בתרבות לזמן הנדרש לבדיקות בעתיד.

Representative Results

תרבויות של נוירונים DRG ניתק לייצג מתאימות במודל חוץ גופית לחקר תאי עצב חדש. עם זאת, מצעים שלא טופלו לא מספקים סביבה מתאימה לקובץ מצורף DRG והרחבה של neurites. כמו SC-ASC מסוגל לייצר גורמי גדילה וכמוקינים 19 אשר יכולה לשפר את היכולת של נוירונים DRG לנבוט neurites כאשר הם משתחררים במדיום התרבות. הנוכחות של ASC כמו SC-במערכת התרבות ולכן יכולה לשחק תפקיד חשוב בויסות פונקציות DRG. פרוטוקול זה (איור 1) ממחיש את ההליך כדי לבצע שיתוף תרבות ישירה של נוירונים ASC וDRG כמו SC-, שבמהלכו תאים עצביים לקבל בקשר ישיר עם ASC כמו SC-זרע בעבר. הקושי העיקרי הקשורים בהליך זה הוא שונות הגבוה של מספר הנוירונים DRG שנקטפו מבעלי חיים שונים. מסיבה זו, תוצאות יכולות להיות לפעמים קשה comparדואר ותשומת לב מיוחד צריכים להיות משולם במהלך הליך הזריעה כדי להשיג תמיד צפיפות תאים דומה בכל ניסוי. הפרוטוקול כבר מותאם להפחתה לפחות את מספר תאי לווין שנותרו מניתוק נוירון DRG באמצעות שיפוע BSA (שלב 3.11). בנוסף, תוספת ציטוזין-arabinose (ARA-C) ניתן להוסיף למדיום BS כדי למזער את אוכלוסיית תאי לווין נוסף, כפי שתוארה על ידי et al Kingham. 11. עם זאת, הבחירה של זמן הטיפול צריכה להיות מאוזן היטב עם DRG וחיוניות ASC כמו SC-, השפיע גם על ידי הנוכחות של תוספת ARA-C במדיום התרבות. לכן, זה מאוד קשה להשיג בחינם-מערכת תא לווין. איור 2 מראה את החשיבות של ASC כמו SC-לneurite DRG הנבטה במודל שיתוף תרבות באמצעות פולי שלא טופלו וכימי-שונה – סרטי caprolactone (PCL) כמו מצעים. הנוירונים DRG היו maintained בתרבות במשך 3 ימים בנוכחות או עדר של ASC כמו SC-, באמצעות פתרון מעורב המכיל 50% של מדיום BS ו -50% של מדיום התמיינות תאי גזע, כפי שמתואר בשלב 4.5. בעקבות תקופה זו, תאים היו קבועים paraformaldehyde 4% ומוכתמים בβ טובולין III (נוירונים DRG) וS100 (ASC כמו SC-) לחקור מורפולוגיה של תאים וללמוד את היכולת של נוירונים DRG כדי לבלוט neurites. אין neurites נצפתה על משטחים שלא טופלו בהעדר ASC (איור 2 א) כמו SC-, תוך היווצרות neurites שופרה במערכת שיתוף התרבות (איור 2 ג) באופן ברור. בממוצע, מספר neurites לגוף תא גדל באופן משמעותי 0-3 בנוכחותם של תאי גזע. אישור לתוצאות אלה ניתנו גם על ידי סריקה מיקרוסקופי אלקטרונים ניתוח (SEM), שמוצג באיור 3. בפרט, תמונות SEM מראות כי היכולת של הנוירונים DRG לנבוט neurites מתרחשת באופן מועדף בשיתוףעם ASC כמו SC-, כפי שצוין על ידי החצים הצהובים באיור 3 ג. יש לציין שהשימוש במצעים-שונה laminin (כוללים פפטידים המופק laminin) במערכות תרבות המכילות נוירונים DRG הוגדר לעתים קרובות כתנאי מתאימים לתרבית תאים עצבית, שיש השפעות מדהימות על היווצרות והארכת neurite 30-32 . עם זאת, התוצאות מוצגות באיור 2 ד ו איור 3D מראות כי השילוב של אותות כימיים וביולוגיים נוסף יכול לשפר את התגובה של נוירונים DRG. הכנת איור 1. של מערכת שיתוף תרבות ASC כמו DRG-SC הישירה. נוירונים DRG וASC נגזרים בהתאמה מעמוד השדרה והשומן הקרביים ומפשעה של mal הבוגרחולדות הדואר Sprague-Dawley. לאחר העיכול של רקמת השומן דרך מפל של תגובות אנזימטיות, ASC נבדל לתאים כמו SC-ונשמר בתנאים תת-מחוברות עד הצורך. ASC כמו SC-הם מראש זרע על כל שעה מצע 24 לפני קציר DRG. ביום, הנוירונים DRG מופקים וניתקו באמצעות סדרה של פעולות אנזימטיות ומכאניות. אז נוירונים הם זורעים בחלק העליון של ASC כמו SC-זרע בעבר ומתוחזק בתרבות עד assayed (בינוני מעורבת: מכילים 50% של מדיום התמיינות תאי גזע ו -50% של מדיום BS שונה). אנא לחצו כאן לצפייה גדולה יותר גרסה של נתון זה. איור 2. תמונות הקרינה של נוירונים DRG בתנאי תרבות מגוונים.() סרטים PCL שלא טופלו; (ב) סרטי PCL שונה-RGD; (ג) שיתוף תרבותי עם ASC כמו SC-על סרטי PCL שלא טופלו; (ד) שיתוף תרבותי עם ASC כמו SC-על סרטי PCL שונה-RGD. תאים נשמרו בתרבות במשך 3 ימים באמצעות פתרון מעורב המכיל 50% של מדיום BS שונה ו -50% מבינוניים התמיינות תאי גזע. לאחר פרק זמן זה, תאים היו קבועים paraformaldehyde 4%, permeabilized בפתרון Triton-X, ואתרי קישור שאינם ספציפיים חסומים עם BSA 1%. תאים עצביים אז היו מוכתמים נגד β טובולין III (FITC; ירוק) וASC כמו SC-נגד S-100 (AlexaFluor568; אדום) נוגדנים. לבסוף גרעינים הוכתמו DAPI (כחול). תמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אולימפוס BX60, יפן). (Re-הדפסה באישור דה לוקה et al. 30. אנא לחץ כאן לצפייה בvers גדוליון של נתון זה. איור 3. תמונות SEM של נוירונים DRG בתנאי תרבות מגוונים () סרטי PCL שלא טופלו (B) סרטי PCL שונה-RGD;. (ג) שיתוף תרבותי עם ASC כמו-SC על סרטי PCL שלא טופלו; (ד) שיתוף תרבותי עם ASC כמו SC-על סרטי PCL-שונה RGD. החיצים הצהובים מצביעים על נקודות המגע בין ASC כמו SC-וDRG, המאשרים האינטראקציה הישירה שלהם במערכת שיתוף התרבות. תאים נשמרו בתרבות במשך 3 ימים וקבועים בglutaraldehyde 2.5%. בעקבות התייבשות בסדרה מדורגת אתנול (50%, 70%, 90%, 100%), תאים היו סוף סוף לשטוף בhexamethyldisilazane ויבש לפני ההרכבה של ספחים וזהב מקרטעות לניתוח SEM. תמונות נרכשו באמצעות SEM (Zeiss EVO60, בריטניה) עם כרך מאיץכאחוז של 10kV. (Re-הדפסה באישור דה לוקה et al. 30. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

הנוירונים DRG משמשים לעתים קרובות בין תאים עצביים לתרבות העיקרית ללמוד את ההתחדשות של תאי עצב לאחר axotomy in vivo. הנה פרוטוקול מדויק לקציר DRG מחולדות מבוגרות מוצג, אשר נועד להקטין את האוכלוסייה של תאי לווין בסביבה מבלי להתפשר על ההישרדות העצבית. כASC המובחן לפנוטיפ כמו SC-הן אלטרנטיבה חוקית לSC לטיפולים בתאים, מערכת שיתוף תרבות ASC / DRG כמו SC-גם תוארה בפירוט.

זה ידוע שlaminin (או נגזר laminin רצפי פפטיד) שיש לו השפעה חיובית על הישרדות נוירון והיווצרות neurite 31-33. בעת ביצוע תרבויות נוירון DRG מומלץ לכן למעייל בעבר כל מצע עם laminin כדי להימנע מכל אובדן פונקציונלי של התאים עצביים. הרעיון של ציפוי laminin חל גם על מצעים ביולוגי לעיצובמבני הנדסת רקמות, כגון פולי – caprolactone (PCL) משמשים לעתים קרובות לייצור של צינורות עצב 30. כמו כן, העבודה קודמת הראתה כי מטריצות הפיברין הן חומרים המתאימים לתרבויות עצביות בתלת ממד 11.

בנוסף לציפוי חלבון, מודלים שיתוף התרבות לספק תנאים חשובים להישרדות תא עצב DRG וסביבה מתאימה ללמוד את יחסי הגומלין המתרחשים בין תאי עצב וSC במערכת העצבים ההיקפית בעקבות פציעה. יכולים גם להיות מושתלים תאים in vivo על ידי שימוש במכשירים עצביים כדי לקצר את זמן הגיוס של תאי אוטולוגי באתר הפציעה. הדבר חשוב במיוחד בפציעות קשות, אשר יכול להוביל להזדקנות תא / מוות וניוון שרירים. למרות SC הם תאי גליה החשובים ביותר המעורבים בתהליך של התחדשות היקפית עצב וmyelination, זמינות המוגבלת שלהם וקצב ההתפשטות האיטי שלהם הופך אותם לבלתי מתאיםעבור יישומי הנדסת רקמות 34. ASC הוא אלטרנטיבה חוקית בשל השפע והיכולת להתמיין לפנוטיפ SC, המבטא סמני גליה ספציפיים ומראה דמיון פונקציונלי לSC יליד 19. ASC הוא גם מסוגל לייצר חלבונים וצמיחת גורמי 5 שיכולים להיות מועיל להיווצרות והארכת neurites ידי נוירונים DRG במערכת שיתוף תרבות. עם זאת, ניתן להגדיר שתי מערכות שיתוף תרבות שונה כפונקציה של צרכי הניסוי. השיטה המוצעת במאמר זה היא גרסה מתוקנת של פרוטוקול מבוסס היטב במעבדה שלנו 11 והוא כרוך במגע ישיר בין שני סוגי התאים (שיתוף תרבות ישירה), שבו הסוג השני תא (תאי עצב DRG) הם זורעים בחלק העליון של אחרים (ASC כמו SC-). גישה זו מבוססת על ממצאים קודמים שהראו את החשיבות של הנוכחות של שכבת תאי גלייה על המצע כאשר זריעת תרבויות עצביות 35 <sup> – 37. השפעה זו היא כנראה עקב תאי תאי אינטראקציות דרך integrins DRG ומולקולות ECM הופקדו מASC ורמזים אחרים על פני השטח של תאי גזע. כמו כן, ציין כי הפחתה של סרום חלבון במדיום הפחיתה את ההתפשטות של זיהום תאי לווין שיכול לנבוע מהניתוק של נוירונים DRG, מבלי להשפיע על פונקציות ASC. עם זאת, תאי לווין, כולל אוכלוסייה קטנה של SC, קשה לחסל לחלוטין מתרבויות של נוירונים DRG וכמה תאים שנותרו גם יהיה נוכח במערכת שיתוף התרבות. לכן חשוב לציין כי תת-אוכלוסיות הקטנות אלה יכולים גם להשתתף בתהליכי myelination במהלך לימודים במבחנה, ונזכרו תאי אוטולוגי שנמצאים in vivo לאחר פציעה. הגישה השנייה (לא מוצג כאן) כרוכה בשימוש בתרבות מוסיף תא, הימנעות מגע ישיר בין שני סוגי התאים שונים (שיתוף תרבות עקיפה). Howevאה, זה לא נציג של תנאי in vivo במהלך רגנרציה עצב (היכולת המופחתת של תאים עצביים לפתח neurites הארוכה), אבל הוא משמש כדי לחקור את ההשפעה של גורמי diffusible שוחררו במדיום על ידי אוכלוסיית תא מסוימת על 38 האחרים .

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work is supported by the National Institute for Health Research, Academy of Medical Sciences and the British Society for Surgery of the Hand. We also gratefully acknowledge the continuing supply of GGF-2 from Acorda Therapeutics, USA. The authors would finally like to acknowledge Prof. Giorgio Terenghi for his valuable support and guidance in our group over the past years that led to the development and optimization of this protocol.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
100 µm cell strainer BD Biosciences 352360 70 μm strainers (ref. 352350) can be used as alternative
15 mL plastic tubes Sarstedt 62.554.002
50 mL plastic tubes Sarstedt 62.547.004
75 cm2 flasks Corning BC301
Retinoic Acid >98% HPLC Sigma R2625
ARA-C supplement Sigma C6645
Recombinant Human FGF-basic (154 aa) Peprotech 100-18B
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9205
Collagenase type I Gibco 17100-017 Note: this collagenase is only used for fat tissue digestion
Collagenase type IV Worthington Biochemical LS004188 Note: this collagenase is only used to dissociate DRG explants
Foetal Bovine Serum (FBS) Biosera FB-1001
Forskolin  Sigma F3917
Glass pipettes Fisher Scientific FB50253 Sharp material to be disposed accordingly
Glial Growth Factor-2 (GGF-2) Acorda Therapeutics GGF-2 was kindly donated by Acorda Therapeutics. For a commercially available alternative, we recommend NRG1-β1 (R & D Systems, Abingdon) for stem cell differentiation to be used at the final concentration of 200ng/ml
Nutrient Mix F12 HAM Sigma N6658 Warm at 37 °C in a water bath unless specified
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma H9394 Warm at 37 °C in a water bath unless specified
N-2 supplement (100x) Invitrogen 17502
Nerve Growth Factor 2.5s Protein, Mouse Submaxillary Glands  (NGF) Millipore NC011
Penicillin-Streptomycin (PS) Sigma P0781
Petri dishes Corning 430165
Recombinant Human PDGF-AA Peprotech 100-13A
Trypsin  Invitrogen 25200-056 Warm at 37 °C in a water bath. This is used for cell detachment from tissue culture flasks
Trypsin (2x bovine pancreatic) Worthington Biochemical LS003703 This is used for DRG dissociation
Minimum Essential Medium Eagle (MEM) Sigma M8042 Warm at 37 °C in a water bath unless specified
2-mercaptoethanol Sigma M3148 Prepare the solution in the biological cabinet
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiberg, M., Terenghi, G. Will it be possible to produce peripheral nerves. Surg Technol Int. 11, 303-310 (2003).
  2. Terzis, J. K., Sun, D. D., Thanos, P. K. Historical and basic science review: past, present, and future of nerve repair. J Reconstr Microsurg. 13 (3), 215-225 (1997).
  3. Bruyns, C. N., Jaquet, J. B., Schreuders, T. A., Kalmijn, S., Kuypers, P. D., Hovius, S. E. Predictors for return to work in patients with median and ulnar nerve injuries. J Hand Surg Am. 28 (1), 28-34 (2003).
  4. Geuna, S., Raimondo, S., et al. Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration. Int Rev Neurobiol. 87 (09), 27-46 (2009).
  5. Kingham, P. J., Kalbermatten, D. F., Mahay, D., Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G. Adipose-derived stem cells differentiate into a Schwann cell phenotype and promote neurite outgrowth in vitro. Exp Neurol. 207 (2), 267-274 (2007).
  6. Stoll, G., Jander, S., Myers, R. R. Degeneration and regeneration of the peripheral nervous system: From Augustus Waller’s observations to neuroinflammation. J Peripher Nerv Syst. 7 (1), 13-27 (2002).
  7. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annu Rev Biomed Eng. 5, 293-347 (2003).
  8. Johnson, E. O., Zoubos, A. B., Soucacos, P. N. Regeneration and repair of peripheral nerves. Injury. 36S (4), S24-S29 (2005).
  9. Liu, R., Lin, G., Xu, H. An efficient method for dorsal root ganglia neurons purification with a one-time anti-mitotic reagent treatment. PloS One. 8 (4), e60558 (2013).
  10. Stettner, M., Wolffram, K., et al. A reliable in vitro model for studying peripheral nerve myelination in mouse. J Neurosci Meth. 214 (1), 69-79 (2013).
  11. Kingham, P. J., Mantovani, C., Terenghi, G. Stem cell and neuron co-cultures for the study of nerve regeneration. Method Mol Biol. 695, 115-127 (2011).
  12. Nissinen, M., et al. Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures. Mol Cell Neurosci. 37 (3), 568-578 (2008).
  13. Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies. Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).
  14. Lewallen, K. a., Aa Shen, Y. -., De la Torre, A. R., Ng, B. K., Meijer, D., Chan, J. R. Assessing the role of the cadherin/catenin complex at the Schwann cell-axon interface and in the initiation of myelination. J Neurosci. 31 (8), 3032-3043 (2011).
  15. Evans, G. R. Challenges to nerve regeneration. Semin Surg Oncol. 19 (3), 312-318 (2000).
  16. Webber, C., Zochodne, D. The nerve regenerative microenvironment: early behavior and partnership of axons and Schwann cells. Exp Neurol. 223 (1), 51-59 (2010).
  17. Tobita, M., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells: current findings and future persperctives. Discov Med. 11 (57), 160-170 (2011).
  18. Faroni, A., Terenghi, G., Reid, A. J. Adipose-derived stem cells and nerve regeneration: promises and pitfalls. Int Rev Neurobiol. 108, 121-136 (2013).
  19. Strem, B. M., Hicok, K. C., et al. Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells. Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).
  20. Xu, Y., Liu, L., et al. Myelin-forming ability of Schwann cell-like cells induced from rat adipose-derived stem cells in vitro. Brain Res. 1239, 49-55 (2008).
  21. Tomita, K., Madura, T., Sakai, Y., Yano, K., Terenghi, G., Hosokawa, K. Glial differentiation of human adipose-derived stem cells: implications for cell-based transplantation therapy. Neuroscience. 236, 55-65 (2013).
  22. Clauser, L., Tieghi, R., Palmieri, A., Carinci, F. Adipose-derived stem cells secrete neurotrophic factors. Annals of Oral and Maxillofacial Surgery. 1 (2), 1-5 (2013).
  23. Di Summa, P. G., Kingham, P. J., Raffoul, W., Wiberg, M., Terenghi, G., Kalbermatten, D. F. Adipose-derived stem cells enhance peripheral nerve regeneration. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (9), 1544-1552 (2010).
  24. Di Summa, P. G., Kalbermatten, D. F., Pralong, E., Raffoul, W., Kingham, P. J., Terenghi, G. Long-term in vivo regeneration of peripheral nerves through bioengineered nerve grafts. Neuroscience. 181, 278-291 (2011).
  25. Sun, F., Zhou, K., Mi, W., Qiu, J. Combined use of decellularized allogeneic artery conduits with autologous transdifferentiated adipose-derived stem cells for facial nerve regeneration in rats. Biomaterials. 32 (32), 8118-8128 (2011).
  26. Zhang, Y., Luo, H., et al. A nerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (20), 5312-5324 (2010).
  27. Gomillion, C. T., Burg, K. J. L. Stem cells and adipose tissue engineering. Biomaterials. 27 (36), 6052-6063 (2006).
  28. Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (1), 514-517 (1979).
  29. Mantovani, C., Raimondo, S., et al. Morphological, molecular and functional differences of adult bone marrow- and adipose-derived stem cells isolated from rats of different ages. Exp Cell Res. 318 (16), 2034-2048 (2012).
  30. Luca, A. C., Faroni, A., Downes, S., Terenghi, G. Differentiated adipose-derived stem cells act synergistically with RGD-modi fi ed surfaces to improve neurite outgrowth in a co-culture model. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
  31. Summa, P. G., Kalbermatten, D., Raffoul, W., Terenghi, G., Kingham, P. J. Extracellular Matrix Molecules Enhance the Neurotrophic Effect of Schwann Cell-Like Differentiated. Tissue Eng. 19 (3-4), 368-379 (2013).
  32. Fudge, N. J., Mearow, K. M. Extracellular matrix-associated gene expression in adult sensory neuron populations cultured on a laminin substrate. BMC Neurosci. 14 (15), 1-19 (2013).
  33. Stabenfeldt, S. E., LaPlaca, M. C. Variations in rigidity and ligand density influence neuronal response in methylcellulose-laminin hydrogels. Acta Biomater. 7 (12), 4102-4108 (2011).
  34. Terenghi, G., Wiberg, M., Kingham, P. J. Chapter 21: Use of stem cells for improving nerve regeneration. Inl Revi Neurobiol. 87 (09), 393-403 (2009).
  35. Richardson, J. a., Rementer, C. W., Bruder, J. M., Hoffman-Kim, D. Guidance of dorsal root ganglion neurites and Schwann cells by isolated Schwann cell topography on poly(dimethyl siloxane) conduits and films. J Neural Eng. 8 (4), 046015 (2011).
  36. Seggio, a. M., Narayanaswamy, A., Roysam, B., Thompson, D. M. Self-aligned Schwann cell monolayers demonstrate an inherent ability to direct neurite outgrowth. J Neural Eng. 7 (4), 046001 (2010).
  37. Xu, F. J., Wang, Z. H., Yang, W. T. Surface functionalization of polycaprolactone films via surface-initiated atom transfer radical polymerization for covalently coupling cell-adhesive biomolecules. Biomaterials. 31 (12), 3139-3147 (2010).
  38. Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G., Kingham, P. J. ECM molecules mediate both Schwann cell proliferation and activation to enhance neurite outgrowth. Tissue Eng. 13 (12), 2863-2870 (2007).

Tags

Dorsal Root GangliaDRG NeuronsAdipose-derived Stem CellsASCSchwann CellsPeripheral Nerve RegenerationCo-cultureIn Vitro Model

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
de Luca, A. C., Faroni, A., Reid, A. J. Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration. J. Vis. Exp. (96), e52543, doi:10.3791/52543 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image