الظهرية جذر العقد الخلايا العصبية والخلايا الجذعية المتباينة الدهنية المشتقة: ل<em> في المختبر</em> المشارك الثقافة نموذج لدراسة الأعصاب الطرفية التجديد
Summary
العقد الجذرية الظهرية (DRG) والهياكل التي تحتوي على الخلايا العصبية الحسية في الجهاز العصبي المحيطي. عندما فصلها، فإنها يمكن أن تكون شارك في تربيتها مع الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة مثل SC (ASC)، وتوفير نموذجا قيما للدراسة في المختبر تجديد الأعصاب وتكون الميالين، ومحاكاة البيئة في الجسم الحي في موقع الإصابة.
Abstract
Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.
Introduction
إصابات الأعصاب الطرفية شائعة مع ما يقرب من 9،000 حالة في المملكة المتحدة التي تحدث كل عام في الغالب الشباب والسكان 1 العامل. وعلى الرغم من تقنيات إصلاح العصبية المجهرية، واستعادة وظيفة طبيعية مستحيلة التحقيق مع ما يترتب على ضعف الإحساس جهة، وانخفاض وظيفة الحركة وآلام متكررة والتعصب الباردة 2. مثل هذه الإصابات يكون لها تأثير عميق ودائم على المريض وقدرتها على أداء أنشطة الحياة اليومية، مع أقل من 60٪ العودة إلى العمل 3.
بعد الإصابة، النمط الظاهري ومورفولوجيا الخلايا العصبية وخلايا شوان (SC) التغيير من أجل خلق بيئة مناسبة للسماح للتنتشر محور عصبي. في حالة transection، وينقسم العصب إلى الداني والقاصي جذوعها. الجدعة الداني كونها نقطة من عملية التجدد التي تجري، في حين أن الجدعة البعيدة يخضع ولري انحطاط فتقوم SC فصلمن محاور عصبية المصاب، دي يفرق وتتكاثر. وهذا أمر أساسي من أجل إزالة الحطام الميلين وإعداد الجدعة البعيدة عن العصبية إعادة الجيل 4،5. ويدعم أكسون تنتشر عن طريق إنتاج العوامل وكيموكينات عصبية الصادرة عن SC في الجدعة البعيدة، وتسترشد الصفيحة القاعدية تركت وراءها التالية انحطاط ولري 6،7. SC محاذاة إلى جانب محور عصبي تجديد تشكيل عصابات من Büngner، التي تساعد على نمو محور عصبي تجاه الجهاز المستهدف، والحد من المتفرعة خارج الأنبوب غمد الليف العصبي. وبعد عودة التعصيب، SC تشكيل غمد المايلين جديد التفاف المحاور مجدد، ولكن فقط استعادة الوظيفة الحسية والحركية جزئيا 8.
العقد الجذرية الظهرية (DRG) والهياكل الموجودة في الثقب فقرات العمود الفقري، التي تحتوي على الخلايا العصبية الحسية التعصيب الأجهزة الطرفية. عندما ينفصل، ويمكن استخدامها بوصفها مناسبة في المختبر وزارة الدفاعشرم لدراسة العصبية تجديد 9-11، بما في ذلك التحقيقات في تشكيل المايلين. على وجه الخصوص، الخلايا العصبية DRG الكبار تحاكي خصائص في الجسم الحي من هذه الخلايا وتوفر أداة هائلة لدراسة استراتيجيات جديدة لإصلاح الأعصاب الطرفية في هندسة الأنسجة.
شارك في الثقافات تمثل النظام الديناميكي الذي يحاكي في المختبر التفاعل بين اثنين (أو أكثر) أنواع الخلايا في بيئة خاصة في الجسم الحي. واحدة من المزايا من هذه النماذج خلية ثقافة مشتركة هي المرونة والتحكم العالية التي يمكن أن تمارس على البيئة خارج الخلية. وقد استخدمت الخلايا العصبية DRG في كثير من الأحيان في النظم شارك في الثقافة مع SC لمحاكاة التفاعلات الفعلية التي تحدث بين أنواع الخلايا اثنين في الجهاز العصبي المحيطي 10،12 – 14. وقد تبين أن SC تفرز المصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتينات وعوامل النمو التي يمكن بشكل ملحوظ تحسينقدرة الخلايا العصبية DRG من أجل البقاء وتنبت neurites التي 15،16. ومع ذلك، SC تتطلب فترات طويلة من الزمن لتتكاثر وعلى الرغم من التقدم في تقنية زراعة الخلايا، فإنه لا يزال من الصعب على توليد عدد مناسب من الخلايا لتطبيقات هندسة الأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، هناك ضرورة للتضحية من العصبية صحي لموسم الحصاد SC ذاتي. ولذلك، فإن الاختلاف في مصادر SC مهم لكلا هندسة الأنسجة واختبار المختبر من تجديد الأعصاب. في طريقة العرض هذه، يمكن اعتبار ASC بديلا قيما للتنمية بناء الأنسجة المهندسة لاستخدامها في إصلاح الأعصاب الطرفية 17،18. أظهرت الأعمال السابقة من قدرة هذه الخلايا على التمايز إلى مثل SC ASC، معربا مميزة الدبقية-علامات، مثل S-100، P75 وييفي الدبقية البروتين الحمضية (GFAP) 19، وكذلك البروتين المايلين صفر (P0) 20 . إفراز عوامل النمو الدبقية، مثل المشتقة من الدماغ عامل التغذية العصبية (BDNF)، لوحظ عامل نمو الأعصاب (NGF) والدبقية مشتقة من خلية عصبية عامل (GDNF) أيضا 21،22. لذلك، مثل SC ASC يمكن استخدام مروج للتجديد الأعصاب الطرفية، كما يتبين من على حد سواء في التجارب المختبرية والدراسات المجراة 23-26. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تحصد ASC من خلال إجراءات الحد الأدنى الغازية في عدد أكبر بالمقارنة مع أنواع الخلايا الجذعية الأخرى؛ تردد للخلايا الجذعية في الأنسجة الدهنية غير 100- إلى 1،000 أضعاف عما كانت عليه في نخاع العظم 27 عاما، وكان لديهم معدل انتشار أعلى مقارنة مع SC ونخاع العظم الخلايا الجذعية الوسيطة.
ويهدف هذا العمل إلى توفير بروتوكول مفصلة لأداء المحاصيل كفاءة عالية من الخلايا العصبية DRG فصل وASC على التوالي، وهذا الأخير يجري متباينة إلى خلايا تشبه SC. لذا فإن الثقافة المشتركة من هذه أنواع الخلايا اثنين من توفير نظام عملي جدا والتي يمكن استخدامها للدراسات المستقبلية على قدرة DRG شمال شرقurons لتنبت neurites التي وآليات تشكيل المايلين على سقالة مختلفة لهندسة الأنسجة العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وكثيرا ما تستخدم الخلايا العصبية DRG بين الخلايا العصبية للثقافة الأولية لدراسة تجديد الخلايا العصبية بعد axotomy في الجسم الحي. هنا يرد بروتوكول دقيقة لDRG الحصاد من الفئران الكبار، تهدف إلى الحد من عدد السكان من الخلايا الأقمار الصناعية في البيئة المحيطة دون المساومة على بقاء الخلايا العصبية. كما ASC متباينة في النمط الظاهري مثل SC هي بديل صالح لSC لعلاجات الخلايا، كما وصف أحد ASC / DRG نظام المشاركة في ثقافة تشبه SC بالتفصيل.
ومن المعروف على نطاق واسع أن laminin (أو تسلسل الببتيد laminin المشتقة) يكون لها تأثير مفيد على بقاء الخلايا العصبية وتشكيل محوار 31-33. ولذلك عند تنفيذ الثقافات الخلايا العصبية DRG ينصح لمعطف من قبل كل الركيزة مع laminin من أجل تجنب أي خسارة في الأداء الوظيفي للخلايا العصبية. ينطبق عليها مفهوم الطلاء laminin أيضا إلى ركائز بيولوجية لتصميميبني هندسة الأنسجة، مثل بولي – caprolactone (PCL) كثيرا ما تستخدم لتصنيع خطوط الأنابيب العصبية 30. أيضا، تظاهر الأعمال السابقة التي المصفوفات الفيبرين هي المواد المناسبة للثقافات العصبية في ثلاثة أبعاد 11.
بالإضافة إلى البروتين والطلاء، وشارك في نماذج من الثقافة توفر الظروف ثمينة للبقاء DRG الخلايا العصبية وبيئة مناسبة لدراسة التفاعلات التي تحدث بين الخلايا العصبية وSC في الجهاز العصبي المحيطي التالية الإصابة. ويمكن أيضا أن خلايا زرعها في الجسم الحي باستخدام الأجهزة العصبية من أجل اختصار الوقت تجنيد خلايا ذاتي في موقع الإصابة. هذا مهم بشكل خاص في إصابات خطيرة، والتي يمكن أن تؤدي إلى الشيخوخة خلية / الموت وضمور العضلات. على الرغم من أن SC هي الخلايا الدبقية أهم المشاركين في عملية تجديد الطرفية العصبية وتكون الميالين، توافرها محدود ومعدل انتشار بطيء بهم يجعلها غير صالحةلتطبيقات هندسة الأنسجة (34). ASC هي بديل صالح بسبب وفرة وقدرتها على التمايز إلى النمط الظاهري للSC، معربا عن علامات الدبقية محددة وإظهار أوجه التشابه وظيفية لالأصلي SC 19. ASC هي أيضا قادرة على انتاج البروتينات ونمو العوامل 5 التي يمكن أن تكون مفيدة لتكوين وتمديد neurites التي كتبها الخلايا العصبية DRG في نظام المشاركة في الثقافة. ومع ذلك، يمكن تعيين نظامين مختلفين ثقافة مشتركة على النحو ظيفة احتياجات التجريبية. الطريقة المقترحة في هذه الورقة هو نسخة منقحة من بروتوكول راسخة في مختبرنا 11 وأنها تنطوي على اتصال مباشر بين أنواع الخلايا اثنين (شارك في ثقافة مباشرة)، والتي هي نوع من الخلايا المصنف الثاني (الخلايا العصبية DRG) في الجزء العلوي من الآخرين (مثل SC ASC). ويستند هذا النهج على النتائج السابقة التي أظهرت أهمية وجود طبقة الخلايا الدبقية على الركيزة عندما البذر الثقافات العصبية 35 <sup> – 37. ومن المرجح بسبب التفاعلات خلية خلية من خلال integrins DRG والجزيئات ECM المودعة من ASC والعظة أخرى على سطح الخلايا الجذعية هذا التأثير. ولوحظ أيضا أن خفض البروتين في الدم على المدى المتوسط خفض انتشار تلويث الخلايا الأقمار الصناعية التي يمكن أن تجنيها من تفكك الخلايا العصبية DRG، دون التأثير على وظائف ASC. ومع ذلك، الخلايا الأقمار الصناعية، بما في ذلك عدد صغير من السكان SC، من الصعب القضاء نهائيا من الثقافات من الخلايا العصبية DRG وعدد قليل من الخلايا المتبقية ستكون أيضا موجودة في نظام المشاركة في الثقافة. ولذلك فمن المهم أن نلاحظ أن هؤلاء السكان الفرعي صغير يمكن أن يشارك أيضا في العمليات تكون الميالين خلال الدراسات في المختبر، إذ يشير إلى الخلايا ذاتي التي تكون موجودة في الجسم الحي بعد الاصابة. النهج الثاني (وليس المقدمة هنا) ينطوي على استخدام إدراج ثقافة الخلية، تجنب الاتصال المباشر بين اثنين من أنواع مختلفة من الخلايا (غير المباشرة المشارك الثقافة). Howevإيه، فإنه ليس ممثل الأوضاع في الجسم الحي خلال تجديد الأعصاب (خفض قدرة الخلايا العصبية لتطوير neurites التي طويلة)، ولكن يتم استخدامه لدراسة تأثير العوامل إنتشاري صدر في المتوسط من السكان خلية معينة على 38 آخرين .
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by the National Institute for Health Research, Academy of Medical Sciences and the British Society for Surgery of the Hand. We also gratefully acknowledge the continuing supply of GGF-2 from Acorda Therapeutics, USA. The authors would finally like to acknowledge Prof. Giorgio Terenghi for his valuable support and guidance in our group over the past years that led to the development and optimization of this protocol.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100 µm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | 70 μm strainers (ref. 352350) can be used as alternative |
| 15 mL plastic tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 50 mL plastic tubes | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 75 cm2 flasks | Corning | BC301 | |
| Retinoic Acid >98% HPLC | Sigma | R2625 | |
| ARA-C supplement | Sigma | C6645 | |
| Recombinant Human FGF-basic (154 aa) | Peprotech | 100-18B | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9205 | |
| Collagenase type I | Gibco | 17100-017 | Note: this collagenase is only used for fat tissue digestion |
| Collagenase type IV | Worthington Biochemical | LS004188 | Note: this collagenase is only used to dissociate DRG explants |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biosera | FB-1001 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 | |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | FB50253 | Sharp material to be disposed accordingly |
| Glial Growth Factor-2 (GGF-2) | Acorda Therapeutics | GGF-2 was kindly donated by Acorda Therapeutics. For a commercially available alternative, we recommend NRG1-β1 (R & D Systems, Abingdon) for stem cell differentiation to be used at the final concentration of 200ng/ml | |
| Nutrient Mix F12 HAM | Sigma | N6658 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma | H9394 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
| N-2 supplement (100x) | Invitrogen | 17502 | |
| Nerve Growth Factor 2.5s Protein, Mouse Submaxillary Glands (NGF) | Millipore | NC011 | |
| Penicillin-Streptomycin (PS) | Sigma | P0781 | |
| Petri dishes | Corning | 430165 | |
| Recombinant Human PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | |
| Trypsin | Invitrogen | 25200-056 | Warm at 37 °C in a water bath. This is used for cell detachment from tissue culture flasks |
| Trypsin (2x bovine pancreatic) | Worthington Biochemical | LS003703 | This is used for DRG dissociation |
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma | M8042 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Prepare the solution in the biological cabinet |
References
- Wiberg, M., Terenghi, G. Will it be possible to produce peripheral nerves. Surg Technol Int. 11, 303-310 (2003).
- Terzis, J. K., Sun, D. D., Thanos, P. K. Historical and basic science review: past, present, and future of nerve repair. J Reconstr Microsurg. 13 (3), 215-225 (1997).
- Bruyns, C. N., Jaquet, J. B., Schreuders, T. A., Kalmijn, S., Kuypers, P. D., Hovius, S. E. Predictors for return to work in patients with median and ulnar nerve injuries. J Hand Surg Am. 28 (1), 28-34 (2003).
- Geuna, S., Raimondo, S., et al. Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration. Int Rev Neurobiol. 87 (09), 27-46 (2009).
- Kingham, P. J., Kalbermatten, D. F., Mahay, D., Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G. Adipose-derived stem cells differentiate into a Schwann cell phenotype and promote neurite outgrowth in vitro. Exp Neurol. 207 (2), 267-274 (2007).
- Stoll, G., Jander, S., Myers, R. R. Degeneration and regeneration of the peripheral nervous system: From Augustus Waller’s observations to neuroinflammation. J Peripher Nerv Syst. 7 (1), 13-27 (2002).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annu Rev Biomed Eng. 5, 293-347 (2003).
- Johnson, E. O., Zoubos, A. B., Soucacos, P. N. Regeneration and repair of peripheral nerves. Injury. 36S (4), S24-S29 (2005).
- Liu, R., Lin, G., Xu, H. An efficient method for dorsal root ganglia neurons purification with a one-time anti-mitotic reagent treatment. PloS One. 8 (4), e60558 (2013).
- Stettner, M., Wolffram, K., et al. A reliable in vitro model for studying peripheral nerve myelination in mouse. J Neurosci Meth. 214 (1), 69-79 (2013).
- Kingham, P. J., Mantovani, C., Terenghi, G. Stem cell and neuron co-cultures for the study of nerve regeneration. Method Mol Biol. 695, 115-127 (2011).
- Nissinen, M., et al. Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures. Mol Cell Neurosci. 37 (3), 568-578 (2008).
- Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies. Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).
- Lewallen, K. a., Aa Shen, Y. -., De la Torre, A. R., Ng, B. K., Meijer, D., Chan, J. R. Assessing the role of the cadherin/catenin complex at the Schwann cell-axon interface and in the initiation of myelination. J Neurosci. 31 (8), 3032-3043 (2011).
- Evans, G. R. Challenges to nerve regeneration. Semin Surg Oncol. 19 (3), 312-318 (2000).
- Webber, C., Zochodne, D. The nerve regenerative microenvironment: early behavior and partnership of axons and Schwann cells. Exp Neurol. 223 (1), 51-59 (2010).
- Tobita, M., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells: current findings and future persperctives. Discov Med. 11 (57), 160-170 (2011).
- Faroni, A., Terenghi, G., Reid, A. J. Adipose-derived stem cells and nerve regeneration: promises and pitfalls. Int Rev Neurobiol. 108, 121-136 (2013).
- Strem, B. M., Hicok, K. C., et al. Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells. Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).
- Xu, Y., Liu, L., et al. Myelin-forming ability of Schwann cell-like cells induced from rat adipose-derived stem cells in vitro. Brain Res. 1239, 49-55 (2008).
- Tomita, K., Madura, T., Sakai, Y., Yano, K., Terenghi, G., Hosokawa, K. Glial differentiation of human adipose-derived stem cells: implications for cell-based transplantation therapy. Neuroscience. 236, 55-65 (2013).
- Clauser, L., Tieghi, R., Palmieri, A., Carinci, F. Adipose-derived stem cells secrete neurotrophic factors. Annals of Oral and Maxillofacial Surgery. 1 (2), 1-5 (2013).
- Di Summa, P. G., Kingham, P. J., Raffoul, W., Wiberg, M., Terenghi, G., Kalbermatten, D. F. Adipose-derived stem cells enhance peripheral nerve regeneration. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (9), 1544-1552 (2010).
- Di Summa, P. G., Kalbermatten, D. F., Pralong, E., Raffoul, W., Kingham, P. J., Terenghi, G. Long-term in vivo regeneration of peripheral nerves through bioengineered nerve grafts. Neuroscience. 181, 278-291 (2011).
- Sun, F., Zhou, K., Mi, W., Qiu, J. Combined use of decellularized allogeneic artery conduits with autologous transdifferentiated adipose-derived stem cells for facial nerve regeneration in rats. Biomaterials. 32 (32), 8118-8128 (2011).
- Zhang, Y., Luo, H., et al. A nerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (20), 5312-5324 (2010).
- Gomillion, C. T., Burg, K. J. L. Stem cells and adipose tissue engineering. Biomaterials. 27 (36), 6052-6063 (2006).
- Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (1), 514-517 (1979).
- Mantovani, C., Raimondo, S., et al. Morphological, molecular and functional differences of adult bone marrow- and adipose-derived stem cells isolated from rats of different ages. Exp Cell Res. 318 (16), 2034-2048 (2012).
- Luca, A. C., Faroni, A., Downes, S., Terenghi, G. Differentiated adipose-derived stem cells act synergistically with RGD-modi fi ed surfaces to improve neurite outgrowth in a co-culture model. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Summa, P. G., Kalbermatten, D., Raffoul, W., Terenghi, G., Kingham, P. J. Extracellular Matrix Molecules Enhance the Neurotrophic Effect of Schwann Cell-Like Differentiated. Tissue Eng. 19 (3-4), 368-379 (2013).
- Fudge, N. J., Mearow, K. M. Extracellular matrix-associated gene expression in adult sensory neuron populations cultured on a laminin substrate. BMC Neurosci. 14 (15), 1-19 (2013).
- Stabenfeldt, S. E., LaPlaca, M. C. Variations in rigidity and ligand density influence neuronal response in methylcellulose-laminin hydrogels. Acta Biomater. 7 (12), 4102-4108 (2011).
- Terenghi, G., Wiberg, M., Kingham, P. J. Chapter 21: Use of stem cells for improving nerve regeneration. Inl Revi Neurobiol. 87 (09), 393-403 (2009).
- Richardson, J. a., Rementer, C. W., Bruder, J. M., Hoffman-Kim, D. Guidance of dorsal root ganglion neurites and Schwann cells by isolated Schwann cell topography on poly(dimethyl siloxane) conduits and films. J Neural Eng. 8 (4), 046015 (2011).
- Seggio, a. M., Narayanaswamy, A., Roysam, B., Thompson, D. M. Self-aligned Schwann cell monolayers demonstrate an inherent ability to direct neurite outgrowth. J Neural Eng. 7 (4), 046001 (2010).
- Xu, F. J., Wang, Z. H., Yang, W. T. Surface functionalization of polycaprolactone films via surface-initiated atom transfer radical polymerization for covalently coupling cell-adhesive biomolecules. Biomaterials. 31 (12), 3139-3147 (2010).
- Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G., Kingham, P. J. ECM molecules mediate both Schwann cell proliferation and activation to enhance neurite outgrowth. Tissue Eng. 13 (12), 2863-2870 (2007).
