Kök Ganglia Nöronlar ve Farklılaştırılmış Yağ-türetilmiş Kök Hücreler Dorsal: bir<em> İn Vitro</em> Co-kültür Modeli Periferik Sinir Rejenerasyon Eğitim

NOT: hayvanları kapsayan tüm deneyler İngiltere Hayvanlar (Scientific Usul) Yasası, 1986 uyarınca yapılmıştır. 1. Deney Seti-up Tüm araçlar steril olup olmadığını kontrol edin, doku ve hücre hasat başlatmak için önce. Gerekli olsun, keskin cerrahi makas, çok ince forseps ve ince standart forseps bir çift otoklav. Ayrıca UV sterilizasyon, etanol pozlama veya uygun olarak buhar sterilizasyon kullanarak hücre tohumlama önce her substrat sterilize. Kök hücre hasat ve farklılaşması için medya hazırlanması % 10 fetal sığır serumu (FBS), 200 mM L-glutamin ve% 1 penisilin-streptomisin (PS) ile takviye edilmiş minimum temel ortam (α-MEM) içeren, kök hücre büyüme ortamı hazırlar. Steril dimetil sülfoksid içinde 2,436 ml forskolin 10 mg çözülmesiyle forskolin 10 mM'lik bir stok çözelti hazırlayın. 14 uM son konsantrasyonda kullanın. </ Li> Steril dimetil sülfoksid 1.43 ml, 50 mg çözülmesiyle retinoik asit, 35 mg / ml stok çözelti hazırlayın. 350 ng / ml nihai konsantrasyonda kullanın. Damıtılmış steril su, 100 ul, liyofilize bir toz, 10 ug çözülmesiyle trombosit türevli büyüme faktörü (PDGF) stokları, (100 ug / ml) hazırlayın. 5 ng / ml nihai konsantrasyonda kullanın. Damıtılmış steril su içinde 500 ul, liyofilize bir toz, 50 ug çözündürülmesiyle temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) stokları, (100 ug / ml) hazırlayın. 10 ng / ml nihai konsantrasyonda kullanın. 14 uM forskolin, 126 ng / ml arasında glial büyüme faktörü-2 (GCF-2), 5 ng / ml trombosit türevi büyüme faktörü (PDGF) ve 10 ng ile takviye edilmiş kök hücre büyüme ortamı içeren, kök hücre farklılaşması ortamı hazırlayın / ml temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF). Nöron hasadı ve ayrılması için ortam ve stok çözeltilerinin hazırlanması Bottenst hazırlayınein ve Ham'ın F12 ortamı,% 1 PS ve% 1, N2 ek ekleyerek Sato'nun (BS) orta 28. (24-iyi plaka kullanılıyorsa) oyuk başına 500 ul olarak gerekli nihai hacim hesaplanır. Ağırlık / hacim olarak% 1.25 konsantrasyonda Ham F12 ortamı içinde kolajenaz IV stokları hazırlayın. 200 ul alikotları olarak -20 ° C'de çözüm ve mağaza Filtre-sterilize. ,% 2.5 ağırlık / hacim konsantrasyonunda Ham F12 ortamı içinde sığır pankreatik tripsin stokları Hazırlama 200 ul alikolar -20 ° C'de filtre-sterilize saklayın. Sinir büyüme faktörü (NGF), 200 ul -20 ° C sıcaklıkta, bir filtre ile sterilize edilmiş 1 mg F12 ortamında ve mağaza / ml yağ asidi-içermeyen sığır serumu albümini (BSA) solüsyonu içinde 5 ug / ml konsantrasyonda stok çözelti hazırlayın alikotları. Hazırlandıktan sonra NGF filtre etmeyin. Durumda, herhangi bir yüzey modifikasyonu, oda sıcaklığında 15 dakika karıştırıldı ve kat lamelleri / poli-D-lisin ile plakanın (0.1 mg / ml gerçekleştirilmiştir) Ve / veya laminin (37 ° C 'de 2 saat süre ile 2-10 ug / cm2) uygun şekilde nöron eki ve nörit gelişimini desteklemektir. Her zaman kullanmadan önce 37 ° C'de su banyosunda medya ısınmak. Bir SC Fenotip içine 2. Yağ kaynaklı Kök Hücre (ASC) Hasat ve Farklılaşma Yetişkin erkek Sprague-Dawley viseral ve kasık yağ ASC hasat Başlatmak Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi yağ hasat kadar buz PS çözeltisi ve mağaza% 1 v / v ile takviye (HBSS) içinde 10-15 ml bir tüp hazırlamak için önce. Servikal dislokasyon ve başları kesilerek sıçan sonlandırın. Iç organların açığa ve kanama kaçınarak, sıçan Tıraş ve karın deri yoluyla bir kesi yapmak. Mide ve bağırsakları (genellikle yağlı sarı tutarlılık ile karakterize) ve yetişkin bir erkek Sprague-Dawley sıçan testisleri çevreleyen kasık yağ encasing visseral yağ çıkarın. Aktarım inciBuz üzerinde HBSS içeren tüp e yağıdır. Biyolojik güvenlik kabini (sınıf II) ince ulaşıldığında bir makas ve ince kıvamına gelene kadar steril bir jilet kullanarak yağ doğrayın ve ağırlık / hacim kollajenaz tip I çözümü taze hazırlanmış% 0.2 15 ml içeren bir tüp içine transfer ve günde filtre ve sterilize edilmiştir. 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde tüp aktarın ve sürekli ajitasyon altında 30 dakika-1 saat süre ile, ve enzim mevcudiyetinde sindirimi yağ dokusu bırakın. Yakından sindirim Monitör ve doku tamamen ayrışmış önce, bu hücre canlılığı ve hücre verimi artıracak durdurun. Filtre 100 mikron hücre süzgecinden doku Theun-ayrışmış. NOT: hafifçe bej görünüm elde, tüp dönen zaman iyi doku sindirim gözle görünür yağ, homojen kıvamda neden olacaktır. C santrifüj 37 ° C'de fetal sığır serumu içeren, kök hücre büyüme ortamı 15 ml ilave etmek suretiyle enzim nötralizetüpün dibinde, kök hücreler dahil stromal vasküler kısmını toplamak amacıyla 10 dakika için 160 g çözelti. Bu aşamada, topak, kırmızı kan hücreleri, 1 ml olarak yeniden süspanse edilebilir kan hücresi neden olduğu kirliliğin çıkarılması için liziz tamponunda. 1 dakika süre ile yeniden süspansiyon haline getirilmesi ve pipetleme sonra, 10 dakika boyunca 160 g taze kök hücre büyüme ortamı ve santrifüj 10 ml ekleyin. Dikkatle altta biriken hücre pelet bakımı, tüpten aspire. Kök hücre büyüme ortamı, 10 ml hücrelerin tekrar 75 cm içine 2 şişeler aktarmak ve 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübe edin. Her 3 günde orta değiştirerek, geçit 1-2 kadar alt-birleşik düzeyde hücreleri koruyun. Bir SC fenotipi ASC farklılaşma Geçit 1-2 içinde 75 cm2 şişeye kök hücre büyüme ortamı çıkarın ve Prepa taze 1 mM β-merkaptoetanol ihtiva eden taze ortam, 10 ml ile değiştirinKırmızı ve günde filtre ve sterilize edilmiştir. 24 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO2 de hücreleri inkübe edin. Bu aşamada, bu hücrelerin farklılaşmasını başlamadan önce düşük yoğunluklu (% 30) tohumlanır önemlidir. Dikkatle HBSS, aspirat hücreleri yıkayın ve 350 ng / ml retinoik asit ihtiva eden bir ortamda 10 ml ile değiştirin. 72 saat için 37 ° C,% 5 CO2 de hücreleri inkübe edin. Işığa hücre orta maruziyetini en aza indirmek için deneyin. (Aşama 1.2.6 bakınız) 3 gün sonra, HBSS, aspirat ile dikkatli bir şekilde yıkama hücreleri ve kök hücre farklılaştırma ortamının 10 ml'si ile değiştirin. Her 3 günde bir ortam değiştirilerek, alt konfluent düzeyde hücreleri koruyun. NOT: (. Kingham ark 5 tarafından gösterildiği gibi) inkübasyon 2 hafta sonra, ASC karakteristik fenotip ifade, SC-benzeri ASC ayrılırlar. Daha sonra davranış 29 gözle görülür bir değişiklik olmadan 10 geçişi kadar kullanılabilir. <p class = "jove_title"> 3. Hasat ve Dorsal Kök Ganglionlar (DRG) Nöronlar Ayrılma Servikal dislokasyon ve başları kesilerek sıçan sonlandırın. Sıçan Tıraş ve omuriliğe maruz cilt kaldırın. Keskin bir makas kullanarak, sınırlı organ ve kan damarlarının ekstra özen omuriliğe excide. Bir Petri kabı kullanarak biyolojik güvenlik kabini (sınıf II) spinal sütun aktarın ve herhangi bir sırt kısmını kaldırın. Kord doku maruz steril ve keskin cerrahi makas kullanarak boyuna ekseni boyunca yarısında omurga bölün. Bu noktada, o kolay DRG nöron hasat sırasında ele yapmak, göğüs kafesinin seviyesinin altında iki küçük segmentlerde omuriliğe kesmek için yararlıdır. Ince forseps kullanarak, hafifçe çekin ve DRG kökleri çıkarmayın dikkat, tüm kord doku kaldırmak. DRG ve kökleri omurga kanallar içinde maruz kalacağı Bu şekilde, hala sütununda kaplı. Beyaz filamentler COMI olarak DRG gözlemleyinkanallarından doğrudan dışarı ng. Ganglionlar kökenlerini zarar değil dikkat, çok ince forseps kullanarak vertebra kanallar derinliklerine gidiyor ve ödeme ile omurga kanallarından tüm DRG kök (sadece DRG) çekin. % 1 PS ile desteklenmiş Ham F12 ortamı 3-4 ml ihtiva eden bir küçük bir petri kabı (60 mm 2) içine DRG aktarın. Farklı hayvanlar kullanıyorsanız, ayrı yemekler kullanın. Bir mikroskop altında, glial hücre kontaminasyonu azaltmak için steril forseps ve bir neşter kullanılarak ganglionlar çevreleyen sinir köklerinin herhangi bir aşırı DRG temizleyin. Taze F12 ortamı, 1.8 ml küçük bir petri (35mm 2) içine DRG aktarın. % 1.25 ağ / h kolajenaz tip IV stok çözeltisi (0.125,% nihai konsantrasyon) 200 ul ilave edin ve 1 saat süre ile 37 ° C,% 5 CO2 de DRG kuluçkalayın. Dikkatlice aspire veya DRG zarar vermemeye dikkat, bir cam pipet ile orta aspire. Taze F12 ortamı esnek EkleDaha önce tarif edildiği gibi,% 0.125 ağırlık / hacim kolajenaz tip IV enzimi ile olmasına ve 1 saat süre ile inkübe edilir. Orta aspire yavaşça F12 ortamı ile DRG yıkayın. F12 ortamı, daha sonra 1.8 ml tripsin 200 ul ilave edin (nihai konsantrasyon% 0.25 ağ / h) ve 30 dakika boyunca 37 ° C,% 5 CO2 inkübe edin. Tripsin çıkarın ve enzimatik reaksiyonu durdurmak için 500 ul FBS ile takviye edilmiş F12 ortamı içinde 1 ml. Orta aspire ve yavaşça serum izlerini çıkarmak için üç kez F12 ortamı ile DRG yıkayın. Taze F12 ortamı içinde 2 ml ilave edilir ve dikkatli bir şekilde bir cam pipet kullanılarak 15 ml'lik bir tüp içine ortam maddesi ile DRG aktarın. Yavaşça (plastik ipuçları alternatif olarak kullanılabilir) cam pipet aşağı (yaklaşık 8-10 kat) kadar pipetleme tarafından DRG nöronlar ayırmak. Topak, tüp dibinde biriken ve yeni bir tüp içinde ortam toplanır. Topaklarını içeren tüp taze F12 ortamı içinde 2 ml ilave edilir ve m tekrarcam pipet ile echanical ayrışma. Süspansiyon homojen (yaklaşık 3-4 kat) olana kadar bu adımı tekrarlayın ve yeni tüp bütün ayrışmış DRG toplamak. Bu yöntem, mekanik ayrışmasından kaynaklanan stresi azaltır ve nöron canlılığını artırır. Un-ayrışmış nöronlar ve diğer enkaz kaldırmak için 100 mikron hücre süzgeç kullanarak yeni bir 15 ml tüp içine çıkan homojenize süspansiyon Filtre. Bu aşamada, ilk önce bir 50 ml tüp içine hücre süspansiyonu filtre ve bir cam pipet ile daha küçük bir tüp içine çözelti transfer uygun olabilir. 5 dakika boyunca 110 g süspansiyon santrifüjleyin. F12 ortamı, 500 ul% 30 BSA çözeltisi 500 ul ilave edilerek% 15 bovin serum albümini (BSA) hazırlayın. Yavaş yavaş kademeli bir protein iz oluşturmak için 15 ml tüp duvarına aşağı çözüm pipetle. Bu aşamada, bu sayılar üzerinde kullanarak BSA 45 ° açıyla tüp tutun ve yavaşça serbest bırakmak için yardımcı oluroluşturan "parça" için bir referans olarak şahin tüp. Tüpün alt kısmında 500 ul bırakarak adım 3.10 gelen süpernatan aspire ve aynı ortam içinde hücre pelletini. Yavaş yavaş daha önce 5 dakika boyunca 500 g aşama 3.11 (bir referans olarak tüp üzerindeki numaraları kullanın) ve santrifüj hazırlanan protein yol boyunca süspansiyonu pipetle. Aşama 4.5 altında tarif edildiği gibi, süpernatan aspire ve modifiye BS ortamı (veya SC-benzeri ASC / DRG ko-kültür için karma bir orta 1 ml pelletini. Not: DRG nöronlarını yeniden askıya almak için ses tohumlanmış istenen nihai hücre konsantrasyonu ve örneklerin sayısına bağlı olarak, gerekli olan gerçek hacme yapılabilir. Bir hayvan, bir 24 yuvalı plaka deney için yeterli hücre sağlar. Hücre bağlantısı oluşturmak için 2 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2 seviyesinde tohumlanmış örnekleri inkübe ve son olarak sinir büyüme fa 50 ng / ml ile takviye edilmiş, taze BS orta ekleyinctor (NGF). SC-benzeri ASC ve DRG Nöronlar 4. Doğrudan Co-kültür Aşama 2.2.3 tarif edildiği gibi alt konfluent seviyelerde kültür SC benzeri ASC koruyun. DRG hasat öncesinde Yirmi dört saat, kök hücre farklılaşması orta aspire ve HBSS hücreleri yıkayın. Aspire ve 3 dakika için 37 ° C,% 5 CO2 de tripsin 3 ml inkübe edilir. Tüm hücreler şişeden çözülmüş olan bir ışık mikroskobu altında edin. Yavaşça dekolmanı yardım şişeyi dokunun. Tripsin reaksiyonu durdurmak 5 dakika boyunca 110 g'da bir 15 ml tüp ve santrifüj hücre süspansiyonu toplamak için orta 7 ml ilave edilir. Süpernatan aspire ve kök hücre farklılaştırma ortamının 5 ml hücre pelletini. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve istenen nihai konsantrasyonuna göre hücre süspansiyonu seyreltin. İdeal olarak, 20,000 SC benzeri ASC tohum / cm2 hücrelerinin konfluent tabakası garantisi olacaktır. SC-benzeri TohumVe alt-tabaka üzerinde ASC hücre bağlantıya olanak vermek üzere, 24 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübe edin. 24 saat inkübe edildikten sonra, ortam aspire ve adım 3.14 ve 3.15 de tarif edildiği gibi hücreler üzerine DRG nöronlarını ekleyin. Kök hücre farklılaştırma ortamının% 50 ve BS ortam% 50 ihtiva eden bir karışık ortama orta değiştirin. Buna ek olarak, nihai karışık bir ortam içinde 1-2.5% FBS maddelerin azaltılması DRG ayrışma elde edilen uydu hücreleri, kirletici çoğalmasını önlenmiş olur. 37 ° C,% 5 CO2 de birlikte kültüre örnekleri inkübe ve gelecekteki deneyler için gerekli süre boyunca kültür içinde muhafaza.