Dorsal Root Ganglia neurônios e células-tronco diferenciadas adiposo-derivados: An<em> In Vitro</em> Co-cultura modelo para estudar a regeneração do nervo periférico

Nota: Todos os experimentos envolvendo animais foram realizados em conformidade com os animais do Reino Unido (Scientific Procedures) Act, de 1986. 1. Experimental Set-up Antes de começar a colheita de tecidos e células, verifique se todas as ferramentas são estéreis. Se necessário, autoclave um par de tesouras cirúrgicas Sharp, muito finos fórceps e uma pinça fina padrão. Também esterilizar cada substrato antes da semeadura de células utilizando esterilização UV, a exposição ao etanol ou esterilização a vapor, conforme apropriado. Preparação dos meios para a colheita de células-tronco e diferenciação Preparar o meio de crescimento de células estaminais, contendo Meio Mínimo Essencial (α-MEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 200 mM de L-glutamina, e 1% de penicilina-estreptomicina (PS). Prepara-se uma solução estoque de 10 mM de forskolin por dissolução de 10 mg de forscolina em 2.436 ml de sulfóxido de dimetilo estéril. Use a concentração final de 14? M. </ Li> Prepara-se uma solução estoque de 35 mg / ml de ácido retinóico por dissolução de 50 mg em 1,43 ml de sulfóxido de dimetilo estéril. Utilize a concentração final de 350 ng / ml. Prepare o factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) existências (100 ug / ml) por dissolução de 10 mg de pó liofilizado em 100 uL de água estéril destilada. Use a concentração final de 5 ng / ml. Prepare factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) existências (100 ug / ml) por dissolução de 50 mg de pó liofilizado em 500 uL de água estéril destilada. Utilize a concentração final de 10 ng / ml. Preparar o meio de diferenciação de células estaminais, meio de crescimento contendo células estaminais suplementado com 14 uM de forscolina, 126 ng /, / ml de factor de crescimento glial fator-2 (GGF-2) 5 ng ml crescimento derivado de plaquetas (PDGF), e 10 ng / factor de crescimento de fibroblastos básico ml (bFGF). Preparação de meios e as soluções para a colheita neurônio e dissociação Prepare Bottenstein e Sato (BS) médio de 28, pela adição de 1% de PS e 1% suplemento N2 para meio F12 de Ham. Calcular o volume final necessário como 500 ul por cavidade (se usar uma placa de 24 poços). Preparar stocks de colagenase IV em meio F12 de Ham na concentração de 1,25% p / v. Filtro-esterilizar a solução e armazenar a -20 ° C como alíquotas de 200 ul. Prepare existências tripsina pancreática bovina em meio F12 de Ham na concentração de 2,5% p / v, filtro de esterilizar e armazenar a -20 ° C como alíquotas de 200 ul. Prepare o factor de crescimento do nervo (NGF) solução estoque na concentração de 5 ug / mL em uma esterilizada por filtração solução 1 / ml de albumina de soro bovino isento de ácido gordo (BSA) em meio F12 e armazenar mg a -20 ° C como a 200 ul alíquotas. Não filtrar o NGF após a reconstituição. No caso de nenhuma modificação da superfície foi realizada, lamelas de revestimento / placas com poli-D-lisina (0,1 mg / ml durante 15 min a RT) E / ou laminina (2-10 ug / cm 2, durante 2 horas a 37 ° C) para suportar a ligação e crescimento de neurites de neurónios como apropriado. Sempre aquecer media em um banho de água a 37 ° C antes de usar. 2. derivadas de tecido adiposo Stem Cell (ASC) Colheita e diferenciação em um fenótipo SC ASC colheita de gordura visceral e inguinal do sexo masculino adulto ratos Sprague-Dawley Antes de começar, preparar um tubo com 10-15 ml de solução salina equilibrada solução de Hanks (HBSS) suplementada com 1% v / v de solução de PS e armazenar em gelo até à colheita de gordura. Terminar o rato por deslocamento cervical e decapitação. Raspar o rato e fazer uma incisão através da pele abdominal, expondo os órgãos internos e evitar sangramento. Retirar a gordura visceral, que envolve o estômago e intestinos (geralmente caracterizada por uma consistência amarelo gordo) e a gordura inguinal em torno dos testículos de um adulto masculino Sprague-Dawley. Th de transferênciae gordura no tubo contendo HBSS em gelo. Em uma cabine de segurança biológica (classe II) pique finamente a gordura usando um par de tesouras e uma lâmina de barbear estéril até a consistência fina é atingido e transferi-lo para um tubo contendo 15 ml de 0,2% p / v solução colagenase tipo I preparados e filtrar esterilizado no dia. Transferir o tubo num banho de água a 37 ° C e deixar o tecido adiposo para digerir em presença da enzima durante 30 min-1 h sob agitação contínua. Monitorar a digestão de perto e parar antes que o tecido é totalmente dissociados, isso irá melhorar a viabilidade celular e rendimento celular. Filtrar Theun tecido dissociado através de um filtro de células de 100 mm. NOTA: digestão do tecido Bom resultará na consistência homogênea da gordura, visível a olho nu quando rodando suavemente o tubo, adquirindo uma aparência bege. Neutraliza-se a enzima por adição de 15 ml de meio de crescimento de células estaminais, contendo soro bovino fetal a 37 ° C e centrifuga-se asolução a 160 g durante 10 minutos a fim de recolher a fracção do estroma vascular, incluindo as células estaminais, no fundo do tubo. Nesta fase, o sedimento pode ser ressuspendido em 1 mL de células vermelhas do sangue de tampão de lise para remover a contaminação de células do sangue. Após ressuspensão e pipetagem durante 1 min, adicionar 10 ml de meio de crescimento de células estaminais fresco e centrifugar a 160 g durante 10 min. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante do tubo, tendo o cuidado de o agregado de células depositado no fundo. Ressuspender as células em 10 ml de meio de crescimento de células estaminais, transferi-los para uma frascos de 75 cm2 e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2. Manter as células nos níveis de sub-confluência até passagem 1-2, mudando meio a cada 3 dias. ASC diferenciação para um fenótipo SC Na passagem 1-2, remover o meio de crescimento de células estaminais a partir do frasco de 75 cm2 e substituí-la com 10 ml de meio fresco contendo 1 mM de β-mercaptoetanol recentemente prepavermelho e filtro esterilizado no dia. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 24 horas. Nesta fase, é importante que as células são semeadas a baixa densidade (30%) antes de iniciar a diferenciação. Lavam-se as células cuidadosamente com HBSS, aspirado e substituí-la com 10 ml de meio contendo 350 ng / ml de ácido retinóico. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 72 horas. Tente minimizar a exposição do meio de células à luz. Após 3 dias, as células de lavar cuidadosamente com HBSS, aspirado e substituí-la com 10 ml de meio de diferenciação de células estaminais (ver o passo 1.2.6). Manter as células em níveis sub-confluentes, mudando meio a cada 3 dias. NOTA: Após 2 semanas de incubação, ASC são diferenciadas em ASC SC-like, expressando seu fenótipo característico (como demonstrado por Kingham et al. 5). Eles podem então ser usados ​​até a 10ª passagem, sem alterações visíveis no comportamento 29. <p class = "jove_title"> 3. Colheita e dissociação de raiz dorsal Gânglios (DRG) Neurônios Terminar o rato por deslocamento cervical e decapitação. Raspar o rato e levantar a pele para expor a coluna vertebral. Usando uma tesoura afiada, excide a coluna vertebral tomando cuidado extra dos órgãos confinados e vasos sanguíneos. Transfira a coluna vertebral em uma cabine de segurança biológica (classe II), utilizando uma placa de Petri e remover qualquer parte dorsal. Divida a coluna vertebral ao meio ao longo do eixo longitudinal usando tesouras cirúrgicas estéreis e abruptos para expor o tecido do cordão. Neste ponto, é útil para cortar a coluna vertebral em dois segmentos mais pequenos abaixo do nível da caixa torácica, para torná-lo mais fácil de manipular durante a colheita de neurónios de DRG. Usando uma pinça fina, remova cuidadosamente todo o tecido do cordão, prestando atenção para não puxar e retirar as raízes DRG. Desta forma, o DRG e raízes será exposto dentro dos canais vertebrais, ainda envolto na coluna. Observe DRG como filamentos brancos coming out diretamente dos canais. Retire toda a raiz DRG (não apenas o DRG) dos canais vertebrais usando uma pinça muito finas, aprofundando nos canais vertebrais e prestando atenção para não danificar as raízes dos gânglios. Transferir o DRG em uma pequena placa de Petri (60 mm 2) contendo 3-4 mL de meio F12 de Ham suplementado com 1% de PS. Se utilizando animais diferentes, usar pratos separados. Sob um microscópio de dissecação, limpe o DRG de qualquer excesso de raízes nervosas que rodeiam os gânglios usando uma pinça estéril e um bisturi para reduzir a contaminação de células gliais. Transferir o DRG em uma pequena placa de Petri (35 mm 2) com 1,8 ml de meio F12 fresco. Adicionar 200 ul de solução p / v de colagenase tipo IV estoque 1,25% (concentração final de 0,125%) e incubar a 37 DRG ° C, 5% de CO 2 durante 1 h. Aspirar cuidadosamente o meio com uma pipeta de vidro, prestando atenção para não aspirar ou danificar o DRG. Adicionar meio F12 fresco flexíveltadas com 0,125% p / v enzima colagenase de tipo IV e incubar durante 1 hora, tal como descrito anteriormente. Aspirar o meio e lavar cuidadosamente o DRG com meio F12. Adicionar, em seguida, 1,8 ml de meio F12 e 200 ul de tripsina (concentração final de 0,25% p / v) e incuba-se a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 30 min. Remover tripsina e adicionar 1 ml de meio F12 suplementado com 500 uL de SBF para prender a reacção enzimática. Aspirar o meio e lava-se cuidadosamente a DRG com meio F12 por três vezes para remover vestígios de soro. Adicionar 2 ml de meio F12 fresco e transferir cuidadosamente o DRG com o meio para um tubo de 15 ml usando uma pipeta de vidro. Gentilmente dissociar os neurônios do GRD por pipetagem cima e para baixo (cerca de 8-10 vezes) com a pipeta de vidro (pontas de plástico pode ser usado como alternativa). Permitir que o sedimento para assentar no fundo do tubo e recolher o meio em um novo tubo. Adicionar 2 ml de meio F12 fresco ao tubo contendo o sedimento e repetir o mdissociação echanical com a pipeta de vidro. Repita este passo até que a suspensão torna-se homogêneos (cerca de 3-4 vezes) e recolher todo o DRG dissociada no novo tubo. Este método reduz o stress decorrente da dissociação mecânica e melhora a viabilidade dos neurónios. Filtra-se a suspensão homogeneizada resultante para um novo tubo de 15 mL, utilizando um filtro pm célula 100 para remover os neurónios não-dissociados e outros detritos. Nesta fase, pode ser conveniente para a primeira filtrar a suspensão de células para um tubo de 50 ml e, em seguida, transferir a solução para o tubo mais pequeno utilizando uma pipeta de vidro. Centrifugar a suspensão a 110 g durante 5 min. Prepara-se uma albumina de soro de bovino 15% (ASB) pela adição de 500 ul de uma solução de BSA a 30% para 500 mL de meio F12. Pipetar lentamente a solução para baixo a parede de um tubo de 15 ml a criar uma fuga gradual proteína. Nesta fase, é útil para manter o tubo num ângulo de 45 ° e libertam lentamente a BSA utilizando os númeroso tubo falcon como referência para a formação de "faixa". Aspirar o sobrenadante do passo 3.10 deixando 500 ul na parte inferior do tubo e ressuspender o sedimento de células no mesmo meio. Lentamente pipetar a suspensão ao longo da trilha proteína previamente preparado no passo 3,11 (use os números sobre o tubo como referência) e centrifugar a 500 g por 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de meio BS modificada (ou uma forma mista, para a ASC / DRG de co-cultura do tipo SC, como descrito abaixo no passo 4.5. NOTA: O volume de re-suspender os neurónios DRG pode ser feita até o volume real necessário, dependendo da concentração celular final desejado e o número de amostras a serem semeadas. Um dos animais irá fornecer células suficientes para uma placa de 24 poços experimento. Incubar as amostras inoculadas a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 2 h, para permitir a fixação das células e, finalmente, adicionar meio BS fresco suplementado com 50 ng / ml de fa de crescimento do nervoctor (NGF). 4. Direta Co-cultura de ASC SC-like e DRG Neurônios Manter ASC do tipo SC, em cultura em níveis sub-confluentes, como descrito no passo 2.2.3. Vinte e quatro horas antes da colheita de DRG, aspirar o meio de diferenciação de células-tronco e lavar as células com HBSS. Aspirar e incubar em 3 ml de tripsina a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 3 min. Verificar sob um microscópio de luz que todas as células terem destacado do balão. Bata levemente no frasco para ajudar desapego. Adicionar 7 ml de meio para parar a reacção de tripsina, recolher a suspensão celular num tubo de 15 ml e centrifugar a 110 g durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 5 ml de meio de diferenciação das células estaminais. Contar as células utilizando um hemocitómetro e diluir a suspensão de células de acordo com a concentração final requerida. Idealmente, semeando 20.000 SC-like ASC / cm 2 garantiria uma camada confluente de células. Semente da SC-likeASC sobre o substrato e incuba-se a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 24 h, para permitir a fixação das células. Após 24 horas de incubação, aspirar o meio e adicionar os neurónios DRG em cima das células tal como descrito no passo 3.14 e 3.15. Mudar a forma de uma forma mista, contendo 50% de meio de diferenciação de células-tronco e 50% de meio BS. Além disso, a redução da concentração de 1-2,5% de FBS em meio misto final ajuda a evitar a proliferação de células satélites contaminantes derivados da dissociação DRG. Incubar as amostras co-cultivadas a 37 ° C, 5% de CO 2 e manter em cultura durante o tempo requerido para testes futuros.