Intratraqueal (IMIT) instilação mediada por intubação: A não-invasiva, sistema de entrega Lung-specific
Summary
Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.
Abstract
Estudos de doenças respiratórias envolvem tipicamente a utilização de sistemas de modelos murinos como substitutos. No entanto, existem diferenças fisiológicas significativas entre os sistemas respiratório humano e murino, especialmente em suas vias respiratórias superiores (URT). Nalguns modelos, estas diferenças na cavidade nasal de murino podem ter um impacto significativo sobre a progressão da doença e na apresentação do trato respiratório inferior (LRT) quando se utiliza técnicas de instilação intranasal, limitando potencialmente a utilidade do modelo de rato para estudar estas doenças. Por estas razões, seria vantajoso desenvolver uma técnica para instilar bactérias directamente para os pulmões do rato, a fim de estudar a doença de LRT na ausência de envolvimento do TRS. Temos chamado este específico intratraqueal técnica entrega intubação mediada (IMIT) instilação de pulmão. Esta técnica não invasiva minimiza o potencial para a instilação para a corrente sanguínea, o que pode ocorrer durante traditi mais invasivaonal abordagens cirúrgicas intratraqueais infecção, e limita a possibilidade de entrega do aparelho digestivo incidental. IMIT é um processo de duas etapas em que ratinhos são entubados em primeiro lugar, com um passo intermédio para assegurar a colocação correcta do cateter para dentro da traqueia, seguido da inserção de uma agulha romba para dentro do cateter para mediar a entrega directa das bactérias para o pulmão. Esta abordagem facilita uma eficácia de> 98% de entrega para os pulmões com uma excelente distribuição de reagente ao longo pulmão. Assim, IMIT representa uma nova abordagem para estudar a doença de LRT e entrega terapêutica directamente no pulmão, após a melhorar a capacidade de usar ratos como substitutos para estudar a doença respiratória humana. Além disso, a precisão e reprodutibilidade deste sistema de entrega também faz com que seja passível de Boas Práticas de Laboratório (BPL) Normas, bem como a entrega de uma ampla gama de reagentes que requerem a entrega de alta eficiência para o pulmão.
Introduction
Os ratinhos foram usados para modelar numerosas manifestações de doenças humanas, incluindo uma miríade de doenças respiratórias. Modelos de doenças substitutos são frequentemente incapazes de recapitular todos os aspectos de uma doença modelado, normalmente devido a diferenças fisiológicas importantes ou imunes nos dois modelos de acolhimento. Assim, o objetivo de melhorar os sistemas de modelos é desenvolver abordagens que permitem substitutos para espelhar mais de perto um processo de doença ou resposta do hospedeiro, como observado no sistema host original. Existem várias diferenças fisiológicas principais entre os ratos e os seres humanos no mecanismo pelo qual eles inspirar ar. Incluídos nestes diferenças são diferenças raciométrica significativas de tamanho entre a URT e LRT. Estimou-se que os ratos possuem> 100 vezes a área de superfície TRS relação aos seres humanos, normalizados contra 1,2 capacidade pulmonar total. Assim, os cornetos nasais do mouse permitem mais ampla filtragem do ar inspirado para facilitar uma maior taxa de breathing, o que pode ter um impacto significativo sobre os estudos de pneumonia se a infecção da cavidade nasal desempenha um papel significativo na progressão da doença.
Várias abordagens diferentes têm sido empregues para incutir bactérias nos pulmões de ratos para estudar a doença respiratória semelhante à humana. A mais comum destas abordagens é a inoculação intranasal, no qual uma suspensão líquida é aplicada em uma ou ambas as narinas de um rato. Embora relativamente simples, advertências como volume instilação e tipo de anestesia utilizada pode afetar a eficiência da instilação no LRT via intranasal inoculação 3-5. Especificamente, Miller et al. demonstraram que a instilação intranasal de Francisella tularensis em volumes de menos de 50 ul não resultou em instilação das bactérias no LRT 6. Eles observaram ainda melhor LRT instilação ao usar isoforane ao contrário de injetado cetamina / xilazina para anestesia. No entanto, o nosso experience com Yersinia pestis inoculação intranasal indica a inoculação mais consistente pode ser conseguida utilizando cetamina / xilazina, em comparação com isoflurano (MBL, dados não publicados). Estas diferenças podem ser atribuídas ao patógeno utilizado ou à variação nos procedimentos de laboratório, mas importante destacar a variabilidade potencial desta técnica. Além disso, os pulmões colhidos logo após a instilação intranasal mostram que uma percentagem relativamente baixa do inoculo bacteriano inicial atinge o pulmão (no caso de Y. pestis, apenas 10% foram recuperados 1 h após a instilação 7), sugerindo que um grande número de bactérias pode ser retida no TRS (ou engolido no tracto GI). Em certos modelos de doenças, esta deposição significativa de bactérias na mucosa URT pode confundir o nosso entendimento da progressão da doença, se o organismo é capaz de colonizar a cavidade nasal murino de forma incompatível com a doença humana. Por exemplo, usando in vivo </ Em> imagiologia, tem-se observado que Burkholderia pseudomallei, que não colonizar o TRS humano, provoca uma infecção oportunista esmagadora da cavidade nasal de murino quando entregue pelo método de instilação intranasal 8.
Outros métodos de instilação de bactérias nos pulmões de ratos também foram empregues na pesquisa de doenças infecciosas. No entanto, em comparação com instilação intranasal estes métodos tendem a exigir mais conhecimentos técnicos e / ou equipamentos caros, sem eliminar o potencial de iniciação infecção em vários locais (por exemplo, aerosol [URT e LRT]; transoral [trato digestivo e LRT]; e intratraqueal cirúrgico [LRT e sangue]). Dadas as potenciais complicações que poderiam estar associados com sites secundários de infecção, buscou-se desenvolver uma abordagem intratraqueal que ignora a URT e entrega patógeno diretamente para os pulmões de ratos anestesiados, mas também limita inoculat inadvertidaíon na corrente sanguínea ou do trato gastrointestinal. Para este fim, intratraqueal (IMIT) instilação mediada por intubação foi desenvolvido como um procedimento não-cirúrgico que garante LRT instilação de inoculo por inclusão de um passo intermediário para verificar a colocação do cateter adequado antes da instilação. Este método é descrito usando corante de instilação para demonstrar visualmente ampla distribuição do inoculo em todo o pulmão, e P. aeruginosa instilação para demonstrar a entrega altamente eficaz (> 98% do inoculo) do presente método para o pulmão. É importante ressaltar que, enquanto originalmente desenvolvido para entrega bacteriana, IMIT também oferece uma ferramenta eficaz para: i) a instilação de várias moléculas para o estudo de outros modelos de doenças respiratórias, ii) a entrega terapêutica específica do pulmão, e iii) os estudos de função pulmonar de base, incluindo alvo siRNA entrega ao pulmão.
Protocol
Representative Results
Discussion
IMIT instillation offers key improvements to existing respiratory disease models in the ability to reproducibly instill reagents directly into the lung. It is a rapid approach which is ideally situated for a team of two researchers, one of which manages the logistics of anesthesia and caging, and the other who performs the IMIT technique. Large studies may be conducted using IMIT with an average time commitment of 2 – 3 min per mouse. Because the approach makes use of isoflurane as an anesthetic, mice recover rapidly from the anesthesia, reducing the husbandry time of monitoring animals through recovery.
The most technically challenging aspect of the IMIT method is the initial step of intubating mice. Individuals learning to perform IMIT are able to focus on this first step of catheter placement and ensuring that intubation has been achieved through the visual confirmation of dye movement. The benefit of the approach is that lung-specific instillation is guaranteed through use of the confirmation of intubation, which increases the confidence of both the new researcher as well as the expert attempting to intubate a difficult animal. The key elements of optimizing the likelihood of a successful intubation are: i) achieving a deep sedation to allow sufficient working time, ii) correct placement of the specula in the mouth to allow good visualization of the epiglottis, iii) good depth placement of the specula so that the tongue remains retracted throughout the procedure, and iv) use of the tilting platform to support the researcher’s hands so that the procedure is conducted relaxed and with a steady approach.
One of the limitations of the IMIT procedure is related to frequency of IMIT instillation events. Due to the potential trauma associated with a missed intubation, it is not recommended that more than two intubation attempts be conducted in a single session (up to two misses). IMIT has an excellent potential in its ability to be used to deliver therapeutics into the murine lung, however therapeutic regimens which make use of very frequent delivery of reagent into the lung may not be suitable for IMIT. It may be possible that IMIT could be used daily to deliver reagents into a murine lung without causing significant trauma, but only when conducted by a highly skilled researcher, as the majority of trauma associated with intubation is thought to be associated with a missed intubation event. Such high-frequency IMIT should be discussed with local veterinarians and IACUC.
An additional potential limitation of IMIT is the size of the mouse which is being intubated. The IMIT procedure described above was developed using mice of approximately 17 – 22 g, where a 20 G catheter was found to be a suitable size for the trachea of mice in this size range. Larger catheters have been successfully used in older mice; the initial development of IMIT made use of an 18 G catheter in BALB/c mice which are >20 g. Importantly, if alternate catheter sizes are used, blunt needles should be sourced which fit the lumen of the catheter and are trimmed to a length that extends just 1mm beyond the catheter tip. Intubation of mice smaller than 17 g may be possible but is not recommended due to the expertise required, and would require use of smaller catheters and specula than are described above.
We have used IMIT for the delivery of several respiratory pathogens in addition to P. aeruginosa, including B. pseudomallei9 and Klebsiella pneumoniae10. The IMIT model has made important advances to our studies of B. pseudomallei respiratory disease, having identified that intranasal inoculation causes an early, URT-related morbidity of mice rather than the systemic disease endpoint observed in human disease9. B. pseudomallei is a Tier 1 select agent of biodefense impact, and as such, respiratory disease models are being developed for aerosol exposure which models a potential biodefense related route of entry for weaponized pathogens. Because current aerosol models result in infection of both the URT and LRT, the same potential early morbidity phenotypes we have identified for the intranasal model of B. pseudomallei respiratory disease may apply to the aerosol model. A future adaptation of the IMIT model could be an intubation-mediated aerosol delivery (IMAD), in which mice are intubated for target aerosol delivery only into the lung. Mechanical ventilators are currently available to maintain isoflurane anesthesia, which could be adapted to deliver an aerosolized, rather than liquid based, pathogen challenge.
IMIT was developed initially as an approach to optimize the delivery of bacteria to the lung, but also has application for the delivery of other reagents into the mouse lung. As discussed above, intranasal delivery of compounds into mice results in a low efficiency, highly variable delivery of reagents into the target organ of the lung. Intranasal delivery of Positron Emission Tomography (PET) imaging reagents to the murine lung yielded a 40% delivery efficiency11, whereas we have demonstrated that IMIT offers an excellent alternative to other lung delivery approaches with its >98% delivery efficacy and multilobar distribution. This improvement in targeted delivery to the lung has the potential to increase the reproducibility of therapeutic delivery for treatment of pulmonary disease. IMIT could similarly offer benefits to studies of: i) the impact of environmental pulmonary irritants, ii) lung cancer phenotypic studies, iii) lung-specific siRNA knock-down.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful for the support from the Center for Predicative Medicine Animal Models (Carol Vanover, Ashley Biller and Jennifer Kraenzle) and Microbiology (Daniel Cramer and Julie Sotsky) Core Facilities. This work was supported by funding from the NIH (HHSN272201000033I to M.B.L and J.M.W.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC | 000A3467 | Base should be detached when working in a BSC |
| Operating Otoscope Head | Welch Allyn | 21700 | |
| Otoscope 3.5 V Li Battery | Welch Allyn | 71900 | |
| Mouse Intubation Specula short, Autoclaveable | Hallowell EMC | 200A3589S | |
| Incisor Loops | Hallowell EMC | 210A3490A | |
| Cotton fine tip applicator | Puritan | 871-PC DBL | Used for tongue retraction |
| I.V. Catheter, 20G | Exel Int | 26741 | Optional: fit a silicon sleeve with 10mm exposed catheter surface |
| Gas tight syringe, 250ul | Hamilton | 81120 | Used for delivery of liquid inoculum by IMIT |
| Blunt Needle, 22G | Hamilton | 91022 | Trim to length to protrude 1mm from 20G catheter |
| Guide wire (Fiber optic wire, 0.5mm) | TheFiberOpticStore.com | FOF .50 | Cut to 6" length: used as guide wire for intubation |
| Tuberculin syringe, 1ml | Becton Dickinson | 309659 | Assemble with fiber optic wire as guide wire |
| Brilliant Blue R (Coomassie) | Sigma | B0149 | |
| Tygon tubing, 1/16" | Saint Gobain | ALC00002 | |
| Male luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45503-22 | |
| Female luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45500-00 | |
| Lidocaine, USP | Spectrum | LI102 | pH lidocaine into solution at 2%(w/v) pH7.0 |
| Sample bag, 1oz | Whirl-Pak | B01067 | |
| U-bottom 96 well plate, sterile | Greiner | 650161 |
References
- Reznik, G. K. Comparative anatomy, physiology, and function of the upper respiratory tract. Environ Health Perspect. 85, 171-176 (1990).
- Hoyt, R. F. J., Hawkins, J. V., St. Clair, M. B., Kennet, M. B., Fox, J. G., et al. Chapter 2. The Mouse in Biomedical Research, Volume 2, Second Edition: Diseases (American College of Laboratory Animal Medicine). 2, 23-90 (2007).
- Visweswaraiah, A., Novotny, L. A., Hjemdahl-Monsen, E. J., Bakaletz, L. O., Thanavala, Y. Tracking the tissue distribution of marker dye following intranasal delivery in mice and chinchillas: a multifactorial analysis of parameters affecting nasal retention. Vaccine. 20, 3209-3220 (2002).
- Eyles, J. E., Spiers, I. D., Williamson, E. D., Alpar, H. O. Tissue distribution of radioactivity following intranasal administration of radioactive microspheres. J Pharm Pharmacol. 53, 601-607 (2001).
- Southam, D. S., Dolovich, M., O’Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 282, 833-839 (2002).
- Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS ONE. 7, (2012).
- Lathem, W. W., Crosby, S. D., Miller, V. L., Goldman, W. E. Progression of primary pneumonic plague: a mouse model of infection, pathology, and bacterial transcriptional activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17786-17791 (2005).
- Warawa, J. M., Long, D., Rosenke, R., Gardner, D., Gherardini, F. C. Bioluminescent diagnostic imaging to characterize altered respiratory tract colonization by the Burkholderia pseudomallei capsule mutant. Front Microbiol. 2, 133 (2011).
- Gutierrez, M., Pfeffer, T. L., Warawa, J. M. Type 3 Secretion System cluster 3 is a critical virulence determinant for lung-specific melioidosis. Submitted. , (2014).
- Fodah, R. A., et al. Correlation of Klebsiella pneumoniae comparative genetic analyses with virulence profiles in a murine respiratory disease model. PLoS ONE. In revision, (2014).
- Soto-Montenegro, M. L., et al. Assessment of airway distribution of transnasal solutions in mice by PET/CT imaging. Mol Imaging Biol. 11, 263-268 (2009).
