Intubation médiation intratrachéale (GI-TI) instillation: un système de distribution non invasive, Lung-spécifique
Summary
L'intubation trachéale à médiation (IMIT) instillation de réactifs est une excellente méthode non invasive pour l'étude de la maladie respiratoire, ainsi qu'un procédé pour inculquer réactifs thérapeutiques directement dans le poumon. Il est une méthode rapide et hautement reproductible qui est approprié pour des essais précliniques.
Abstract
Études sur les maladies respiratoires impliquent généralement l'utilisation de modèles murins que les systèmes de substitution. Cependant, il existe des différences physiologiques importantes entre la souris et l'appareil respiratoire humain, en particulier dans leurs voies respiratoires supérieures (URT). Dans certains modèles, ces différences dans la cavité nasale de souris peuvent avoir un impact significatif sur la progression de la maladie et de la présentation dans les voies respiratoires inférieures (LRT) lors de l'utilisation des techniques d'instillation intranasale, limitant potentiellement l'utilité du modèle de souris pour étudier ces maladies. Pour ces raisons, il serait avantageux de développer une technique d'inculquer bactéries directement dans les poumons de souris pour étudier la maladie de TLR en l'absence d'implication de l'URT. Nous avons appelé cette technique spécifique intratrachéale de livraison intubation médiation (GI-TI) instillation du poumon. Cette technique non invasive réduit au minimum le potentiel pour instillation dans la circulation sanguine, ce qui peut se produire au cours de trad plus invasivechirurgicales approches onal intratrachéales d'infection, et limite la possibilité de livraison digestif accessoire de l'appareil. IMIT est un processus en deux étapes dans lequel les souris sont d'abord intubés, avec une étape intermédiaire pour assurer le placement correct du cathéter dans la trachée, suivis par l'insertion d'une aiguille émoussée dans le cathéter de médiation livraison directe de bactéries dans les poumons. Cette approche facilite une efficacité de livraison> 98% dans les poumons avec une excellente distribution de réactif dans l'ensemble du poumon. Ainsi, IMIT représente une nouvelle approche pour étudier les maladies de TLR et administration de produits thérapeutiques directement dans les poumons, l'amélioration de la capacité d'utiliser la souris comme substituts pour étudier les maladies respiratoires chez les humains. En outre, la précision et la reproductibilité de ce système de livraison rend également prête à des normes de pratique de laboratoire (BPL) bons, ainsi que la livraison d'une large gamme de réactifs qui doivent être livrés à haute efficacité pour les poumons.
Introduction
Les souris ont été utilisés pour modéliser les nombreuses manifestations pathologiques chez l'homme, comprenant une multitude de maladies respiratoires. Des modèles de maladies de substitution sont souvent incapables de récapituler tous les aspects d'une maladie modélisé, typiquement en raison des différences physiologiques importantes ou immunitaires dans les deux modèles d'accueil. Ainsi, le but d'améliorer les systèmes de modèle est de développer des approches qui permettent à des substituts reflètent plus étroitement un processus de maladie ou réponse de l'hôte comme on l'observe dans le système hôte d'origine. Il existe plusieurs différences physiologiques importantes entre les souris et les humains dans le mécanisme par lequel ils inspirer l'air. Parmi ces différences sont des différences significatives ratiométriques de taille entre l'URT et LRT. Il a été estimé que les souris possèdent> 100 fois la RUT surface par rapport à l'être humain, contre normalisée totale de 1,2 capacité pulmonaire. Ainsi, les cornets nasaux de la souris permettent plus vaste filtrage de l'air inspiré à faciliter une plus grande vitesse de breathing, qui peut avoir un impact significatif sur les études de pneumonie en cas d'infection de la cavité nasale joue un rôle important dans la progression de la maladie.
Plusieurs approches différentes ont été utilisées pour inculquer des bactéries dans les poumons de souris pour étudier les maladies respiratoires de l'homme-comme. La plus courante de ces approches est l'inoculation intranasale, dans lequel une suspension liquide est appliquée à une ou aux deux narines de souris. Bien que relativement simple, mises en garde telles que le volume d'instillation et le type d'anesthésie utilisé peut influer sur le rendement de l'instillation dans la LRT par inoculation intranasale 3-5. Plus précisément, Miller et al. ont montré que l'instillation intranasale de Francisella tularensis des volumes de moins de 50 pi n'a pas abouti à l'instillation des bactéries dans le TLR 6. Ils ont observé en outre mieux instillation de TLR lors de l'utilisation de l'isoflurane inhalé par opposition à injection de kétamine / xylazine pour l'anesthésie. Cependant, notre expérience avec Yersinia pestis inoculation intranasale indique inoculation plus cohérente peut être réalisé en utilisant la kétamine / xylazine par rapport à l'isoflurane (MBL, données non publiées). Ces différences pourraient être attribuées à des agents pathogènes ou utilisé à des variations dans les procédures de laboratoire, mais surtout mettre en évidence la variabilité potentielle de cette technique. En outre, les poumons récoltés peu de temps après l'instillation intranasale montrent qu'un pourcentage relativement faible de l'inoculum bactérien initial atteint le poumon (dans le cas de Y. pestis, seulement 10% ont été récupérés 1 heure après l'instillation 7), ce qui suggère qu'un grand nombre de bactéries pourraient être retenus dans le TRS (ou avalé dans le tractus gastro-intestinal). Dans certains modèles de maladies, ce dépôt important de bactéries sur la muqueuse de l'URT peut confondre notre compréhension de la progression de la maladie si l'organisme est capable de coloniser la cavité nasale murin d'une manière incompatible avec la maladie humaine. Par exemple, en utilisant in vivo </ Em> imagerie, il a été observé que pseudomallei, qui ne colonise pas l'URT humaine, provoque une infection opportuniste écrasante de la cavité nasale de souris lors de la livraison par la méthode d'instillation intranasale 8.
D'autres procédés pour inculquer des bactéries dans les poumons de souris ont également été utilisés dans la recherche des maladies infectieuses. Cependant, par rapport à l'instillation intranasale ces méthodes ont tendance à exiger plus de compétences techniques et / ou des équipements coûteux sans pour autant éliminer le risque d'infection initiation à plusieurs sites (par exemple, aérosol [URT et TLR]; transorale [tube digestif et TLR]; et intra-trachéale chirurgicale [LRT et sang]). Compte tenu des complications potentielles qui pourraient être associés à des sites secondaires de l'infection, nous avons cherché à développer une approche intra-trachéale qui contourne l'URT et offre pathogène directement dans les poumons de souris anesthésiées, mais limite également inoculat involontaireions dans le sang ou du tube digestif. À cette fin, intratrachéale (GI-TI) instillation d'intubation médiation a été conçu comme une procédure non chirurgicale qui garantit LRT instillation d'inoculum en incluant une étape intermédiaire pour vérifier le placement de cathéter approprié avant l'instillation. Cette méthode est décrite à l'aide de colorant instillation de démontrer visuellement large répartition de l'inoculum dans tout le poumon, et P. aeruginosa instillation de mettre en évidence la livraison très efficace (> 98% de l'inoculum) de cette méthode pour le poumon. Surtout, alors que développé à l'origine pour la livraison bactérienne, IMIT propose également un outil efficace pour: i) l'instillation de diverses molécules à l'étude d'autres modèles de maladies respiratoires, ii) la prestation thérapeutique spécifique du poumon, et iii) des études de la fonction pulmonaire de base, y compris ciblé délivrance d'ARNi dans les poumons.
Protocol
Representative Results
Discussion
IMIT instillation offre des améliorations importantes aux modèles de maladies respiratoires existantes dans la capacité d'inculquer reproductible réactifs directement dans les poumons. Il est une approche rapide qui est idéalement situé pour une équipe de deux chercheurs, l'un des qui gère la logistique de l'anesthésie et de mise en cage, et l'autre qui exécute la technique de la GI-TI. De grandes études peuvent être réalisées à l'aide IMIT avec un engagement de temps moyen de 2 – 3 min par souris. Parce que l'approche fait usage de l'isoflurane comme anesthésique, les souris récupérer rapidement de l'anesthésie, la réduction du temps de garde des animaux de surveillance grâce à la récupération.
L'aspect le plus difficile techniquement de la méthode de la GI-TI est la première étape de l'intubation souris. Les personnes qui apprennent à effectuer IMIT sont en mesure de se concentrer sur cette première étape de la pose du cathéter et veiller à ce que l'intubation a été réalisé grâce à la confirmation visuelle de mouvement de colorant. L'avantage de cette approche est que poumon-specIFIC instillation est garantie grâce à l'utilisation de la confirmation de l'intubation, ce qui augmente la confiance à la fois du nouveau chercheur ainsi que l'expert de tenter d'intuber un animal difficile. Les éléments clés de l'optimisation de la probabilité d'une intubation sont: i) la réalisation d'un sédation profonde pour laisser le temps de travail suffisant, ii) le placement correct de la spéculum dans la bouche pour permettre une bonne visualisation de l'épiglotte, iii) le placement de bonne profondeur de la spéculum de sorte que la langue reste en retrait tout au long de la procédure, et iv) l'utilisation de la plate-forme basculante pour soutenir les mains du chercheur ainsi que la procédure se déroule détendu et avec une approche stable.
Une des limites de la procédure de IMIT est liée à la fréquence des événements IMIT d'instillation. À cause du traumatisme potentiel associé à une intubation raté, il est déconseillé de plus de deux tentatives d'intubation être effectuées en une seule séance (jusqu'à deux accidents). IMITa un excellent potentiel dans sa capacité à être utilisé pour fournir des traitements dans les poumons de souris, les schémas thérapeutiques mais qui font usage de livraison très fréquent de réactif dans les poumons peuvent ne pas convenir pour la GI-TI. Il est possible que la GI-TI pourrait être utilisé tous les jours pour fournir des réactifs dans un poumon de souris sans causer de traumatisme important, mais que lorsqu'ils sont réalisés par un chercheur hautement qualifié, comme la majorité des traumatismes liés à l'intubation est pensé pour être associé à un événement d'intubation manquer . Cette IMIT haute fréquence doit être discuté avec les vétérinaires locaux et IACUC.
Une limitation potentielle supplémentaire de la GI-TI est la taille de la souris qui est intubé. La procédure de IMIT décrit ci-dessus a été développé en utilisant des souris d'environ 17 à 22 g, où un cathéter de 20 G a été trouvé être d'une taille adaptée à la trachée de souris dans cette gamme de tailles. Grandes cathéters ont été utilisés avec succès chez la souris âgées; le développement initial de la GI-TI made utilisation d'un cathéter 18 G dans souris BALB / c qui sont> 20 g. Il est important, si les tailles de cathéters de remplacement sont utilisées, les aiguilles doivent être franches qui proviennent adapter à la lumière du cathéter et sont coupés à une longueur qui étend seulement 1 mm au-delà de l'extrémité du cathéter. Intubation de souris plus petites que 17 g peut être possible mais pas recommandé en raison de l'expertise requise, et nécessitait l'utilisation de cathéters plus petits et spéculums sont que décrit ci-dessus.
Nous avons utilisé IMIT pour la livraison de plusieurs agents pathogènes des voies respiratoires, en plus de P. aeruginosa, y compris B. pseudomallei 9 et 10 Klebsiella pneumoniae. Le modèle de la GI-TI a fait d'importants progrès pour nos études de B. maladies respiratoires pseudomallei, après avoir identifié que l'inoculation intranasale entraîne, une morbidité URT-connexe début de souris plutôt que le critère de la maladie systémique observée dans la maladie humaine 9. B. pseudomallei est un Tier 1 Select l'agent de l'impact de la biodéfense, et que ces modèles de maladies respiratoires, sont en cours d'élaboration pour l'exposition aux aérosols qui modèles liés à la biodéfense un itinéraire potentiel d'entrée pour les agents pathogènes en armes. Parce que les modèles courants d'aérosol entraîner une infection à la fois l'URT et TLR, les mêmes potentiels phénotypes de morbidité début nous avons identifié pour le modèle intranasale de B. maladies respiratoires pseudomallei peut demander au modèle d'aérosol. Une adaptation future du modèle de la GI-TI pourrait être une administration par aérosol intubation médiation (IMAD), dans laquelle des souris sont intubé pour livraison cible d'aérosol dans les poumons seulement. Ventilateurs mécaniques sont actuellement disponibles pour maintenir l'anesthésie isoflurane, qui pourrait être adapté pour fournir un, plutôt que sur la base liquide, défi de l'agent pathogène en aérosol.
IMIT a été développé initialement comme une approche pour optimiser la distribution des bactéries dans les poumons, mais a aussi une application pour la fourniture d'autres réactifs dans les poumons de souris. Comme disjuré ci-dessus, l'administration intranasale de composés chez des souris se traduit par une faible efficacité, livraison très variable des réactifs dans l'organe cible du poumon. L'administration intranasale de positons tomographie par émission (PET) réactifs d'imagerie dans les poumons de souris a donné une livraison efficacité de 40% 11, alors que nous avons démontré que la GI-TI offre une excellente alternative à d'autres la livraison du poumon approches avec son> 98% d'efficacité de la livraison et de la distribution multilobaire. Cette amélioration de la délivrance ciblée dans le poumon a le potentiel d'augmenter la reproductibilité de la libération de produits thérapeutiques pour le traitement de maladies pulmonaires. IMIT pourrait de même offrir des avantages aux études de: i) l'impact des irritants pulmonaires environnement, ii) cancer du poumon études phénotypiques, iii) siRNA spécifiques poumon knock-down.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful for the support from the Center for Predicative Medicine Animal Models (Carol Vanover, Ashley Biller and Jennifer Kraenzle) and Microbiology (Daniel Cramer and Julie Sotsky) Core Facilities. This work was supported by funding from the NIH (HHSN272201000033I to M.B.L and J.M.W.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC | 000A3467 | Base should be detached when working in a BSC |
| Operating Otoscope Head | Welch Allyn | 21700 | |
| Otoscope 3.5 V Li Battery | Welch Allyn | 71900 | |
| Mouse Intubation Specula short, Autoclaveable | Hallowell EMC | 200A3589S | |
| Incisor Loops | Hallowell EMC | 210A3490A | |
| Cotton fine tip applicator | Puritan | 871-PC DBL | Used for tongue retraction |
| I.V. Catheter, 20G | Exel Int | 26741 | Optional: fit a silicon sleeve with 10mm exposed catheter surface |
| Gas tight syringe, 250ul | Hamilton | 81120 | Used for delivery of liquid inoculum by IMIT |
| Blunt Needle, 22G | Hamilton | 91022 | Trim to length to protrude 1mm from 20G catheter |
| Guide wire (Fiber optic wire, 0.5mm) | TheFiberOpticStore.com | FOF .50 | Cut to 6" length: used as guide wire for intubation |
| Tuberculin syringe, 1ml | Becton Dickinson | 309659 | Assemble with fiber optic wire as guide wire |
| Brilliant Blue R (Coomassie) | Sigma | B0149 | |
| Tygon tubing, 1/16" | Saint Gobain | ALC00002 | |
| Male luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45503-22 | |
| Female luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45500-00 | |
| Lidocaine, USP | Spectrum | LI102 | pH lidocaine into solution at 2%(w/v) pH7.0 |
| Sample bag, 1oz | Whirl-Pak | B01067 | |
| U-bottom 96 well plate, sterile | Greiner | 650161 |
References
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