Intubazione-mediata intratracheale (IMIT) instillazione: A non invasiva, Lung-specifico sistema di rilascio
Summary
Intubazione endotracheale-mediata (IMIT) instillazione di reagenti è un eccellente metodo non invasivo per lo studio di malattie respiratorie, come pure un metodo per instillare reagenti terapeutici direttamente nel polmone. Si tratta di un metodo rapido e altamente riproducibile che è adatto per la prova preclinica.
Abstract
Studi sulle malattie respiratorie in genere comportano l'uso di modelli murini come sistemi sostitutivi. Tuttavia, ci sono notevoli differenze fisiologiche tra il topo e respiratorio umano, in particolare nelle loro vie respiratorie superiori (URT). In alcuni modelli, queste differenze nella cavità nasale murino possono avere un impatto significativo sulla progressione della malattia e la presentazione nel tratto respiratorio inferiore (LRT) quando si utilizzano tecniche di instillazione intranasale, potenzialmente limita l'utilità del modello di topo per studiare queste malattie. Per questi motivi, sarebbe vantaggioso sviluppare una tecnica di instillare batteri direttamente nei polmoni topo per studiare la malattia LRT in assenza di coinvolgimento delle vie aeree superiori. Abbiamo chiamato questa specifica tecnica di fornitura intubazione endotracheale-mediata (IMIT) instillazione del polmone. Questa tecnica non invasiva minimizza il potenziale per instillazione nel sangue, che può verificarsi durante tradizio più invasiveapprocci chirurgici onal intratracheali infezione, e limita la possibilità di consegna tratto digestivo incidentale. IMIT è un processo in due fasi in cui i topi vengono prima intubati, con una fase intermedia di garantire il posizionamento del catetere corretta nella trachea, seguiti da inserimento di un ago smussato nel catetere di mediare consegna diretta dei batteri nei polmoni. Questo approccio permette un'efficacia> 98% della fornitura nei polmoni un'eccellente distribuzione del reagente nel polmone. Così, IMIT rappresenta un nuovo approccio per studiare le malattie LRT e spedizione terapeutica direttamente nel polmone, migliorando sulla capacità di utilizzare topi come surrogati per studiare malattie respiratorie umane. Inoltre, la precisione e la riproducibilità del sistema di erogazione rende anche suscettibili di buona prassi di laboratorio (GLP), così come la consegna di una vasta gamma di reagenti che richiedono elevata efficienza di consegna al polmone.
Introduction
I topi sono stati utilizzati per modellare numerose manifestazioni della malattia umana, compresa una miriade di malattie respiratorie. Modelli di malattia surrogate sono spesso in grado di ricapitolare tutti gli aspetti di una malattia modellato, in genere a causa di importanti fisiologica o differenze immunitarie nei due modelli di accoglienza. Pertanto, l'obiettivo di migliorare i sistemi di modello è quello di sviluppare approcci che consentono surrogati a specchio più da vicino un processo patologico o ospitano risposta come osservato nel sistema host originale. Ci sono parecchie differenze fisiologiche fondamentali tra i topi e gli esseri umani nel meccanismo con cui si ispirano l'aria. Inclusi in queste differenze sono significative differenze raziometriche di dimensioni tra vie aeree superiori e LRT. È stato stimato che i topi possiedono> 100 volte la superficie URT rispetto agli esseri umani, normalizzati contro totale 1,2 capacità polmonare. Così, turbinati nasali del mouse consentono più ampio filtraggio dell'aria inspirata per facilitare una maggiore velocità di breathing, che può avere un impatto significativo sugli studi di polmonite se l'infezione della cavità nasale svolge un ruolo significativo nella progressione della malattia.
Diversi approcci sono stati impiegati per infondere batteri nei polmoni di topi per studiare le malattie respiratorie simile a quella umana. Il più comune di questi approcci è inoculazione intranasale, in cui una sospensione liquida viene applicato in una o entrambe le narici di un mouse. Mentre relativamente semplice, avvertimenti come volume instillazione e tipo di anestesia utilizzati possono influenzare l'efficienza della instillazione nel LRT via intranasale inoculazione 3-5. In particolare, Miller et al. hanno dimostrato che l'instillazione intranasale di Francisella tularensis in volumi meno di 50 ml non hanno comportato l'instillazione dei batteri nel LRT 6. Essi hanno inoltre osservato meglio LRT instillazione quando si usa isoflurano per via inalatoria rispetto a iniettato ketamina / xylazina per l'anestesia. Tuttavia, la nostra esperienze con Yersinia pestis inoculazione intranasale indica inoculazione più coerente può essere raggiunto utilizzando ketamina / xylazina rispetto a isoflurano (MBL, dati non pubblicati). Queste differenze potrebbero essere attribuite a patogeno usata o variabilità nella procedure di laboratorio, ma soprattutto evidenziare il potenziale di variabilità in questa tecnica. Inoltre, polmoni raccolte poco dopo instillazione intranasale mostrano che una percentuale relativamente bassa dell'inoculo batterico iniziale raggiunge il polmone (nel caso di Y. pestis, solo il 10% sono stati recuperati 1 ora dopo l'instillazione 7), suggerendo che un gran numero di batteri potrebbe essere mantenuta nel URT (o ingerito nel tratto GI). In alcuni modelli di malattia, questo significativo deposito di batteri sulla mucosa URT può confondere la nostra comprensione della progressione della malattia se l'organismo è in grado di colonizzare la cavità nasale murino in modo incompatibile con la malattia umana. Per esempio, usando in vivo </ Em> di imaging, è stato osservato che Burkholderia pseudomallei, che non colonizzano l'URT umana, provoca un'infezione opportunistica schiacciante della cavità nasale murino al momento della consegna con il metodo instillazione intranasale 8.
Altri metodi per instillare i batteri nei polmoni di topi sono stati impiegati nella ricerca sulle malattie infettive. Tuttavia, rispetto al instillazione intranasale questi metodi tendono a richiedere maggiore competenza tecnica e / o costose attrezzature senza eliminare il rischio di infezione da iniziazione in più siti (ad esempio, aerosol [URT e LRT]; transoral [tubo digerente e LRT], e intratracheale chirurgica [LRT e sangue]). Date le complicazioni potenziali che potrebbero essere associati con i siti secondari di infezione, abbiamo cercato di sviluppare un approccio endotracheale che bypassa vie aeree superiori e fornisce patogeno direttamente nei polmoni di topi anestetizzati, ma limita anche inoculat accidentaleione nel flusso sanguigno o del tratto gastrointestinale. A tal fine, l'intubazione endotracheale-mediata (IMIT) instillazione è stato sviluppato come una procedura non chirurgica che garantisce LRT instillazione di inoculo, includendo una fase intermedia per verificare il corretto posizionamento del catetere prima della instillazione. Questo metodo viene descritto usando colorante instillazione di dimostrare visivamente ampia distribuzione dell'inoculo nel polmone, e P. aeruginosa instillazione per dimostrare la consegna altamente efficace (> 98% dell'inoculo) di questo metodo per il polmone. È importante sottolineare che, mentre originariamente sviluppato per la consegna batterica, IMIT offre anche un efficace strumento per: i) instillazione di varie molecole per lo studio di altri modelli di malattie respiratorie, ii) la consegna terapeutiche particolari-polmone, e iii) studi di funzionalità polmonare di base, tra cui mirate consegna di siRNA al polmone.
Protocol
Representative Results
Discussion
IMIT instillazione offre miglioramenti chiave per modelli di malattie respiratorie già esistenti nella capacità di infondere riproducibile reagenti direttamente nei polmoni. Si tratta di un approccio veloce che si trova in posizione ideale per una squadra di due ricercatori, uno dei quali gestisce la logistica di anestesia e ingabbiamento, e l'altro che esegue la tecnica IMIT. I grandi studi possono essere condotti utilizzando IMIT con un impegno medio di tempo di 2 – 3 minuti per mouse. Poiché l'approccio fa uso di isoflurano come anestetico, topi recuperare rapidamente dall'anestesia, riducendo il tempo di allevamento di animali controllo attraverso il recupero.
L'aspetto più tecnicamente impegnativo del metodo IMIT è il passo iniziale di intubazione topi. Gli individui che imparano a svolgere IMIT sono in grado di concentrarsi su questo primo passo di posizionamento del catetere e la garanzia che l'intubazione è stato raggiunto attraverso la conferma visiva di movimento tintura. Il vantaggio di questo approccio è che il polmone-specific instillazione è garantita attraverso l'uso della conferma di intubazione, che aumenta la fiducia sia del nuovo ricercatore nonché l'esperto tentativo di intubazione un animale difficile. Gli elementi chiave per ottimizzare la probabilità di una intubazione di successo sono: i) il raggiungimento di un sedazione profonda per dare il tempo di lavoro sufficienti, ii) il corretto posizionamento del specula in bocca per permettere una buona visualizzazione della epiglottide, iii) l'inserimento di una buona profondità del specula in modo che la linguetta rimane retratto durante tutta la procedura, e iv) utilizzo della piattaforma di ribaltamento per supportare mani del ricercatore in modo che la procedura è condotta rilassata e con un comportamento costante.
Uno dei limiti della procedura IMIT è legato alla frequenza degli eventi IMIT instillazione. A causa del trauma potenziali associati con intubazione perso, non è consigliabile che più di due tentativi di intubazione essere condotti in una singola sessione (fino a due miss). IMITha un ottimo potenziale nella sua capacità di essere utilizzato per fornire terapie nel polmone murino, i regimi terapeutici ma che si avvalgono di consegna molto frequente di reagente nei polmoni non possono essere adatti per IMIT. Può essere possibile che IMIT potrebbe essere utilizzato quotidianamente per fornire reagenti in un polmone murino senza causare traumi significativi, ma solo se condotta da un ricercatore altamente qualificato, come la maggior parte dei traumi associati con intubazione è pensato per essere associato ad un evento intubazione perdere . Tale IMIT ad alta frequenza dovrebbe essere discusso con i veterinari locali e IACUC.
Un potenziale limite ulteriore IMIT è la dimensione del mouse che viene intubato. La procedura IMIT sopra descritta è stata sviluppata usando topi di circa 17-22 g, dove è stato trovato un catetere 20 G per essere un formato adatto per la trachea di topi in questo intervallo di grandezza. Cateteri più grandi sono stati utilizzati con successo nei topi anziani; lo sviluppo iniziale di IMIT muso facciata di un catetere 18 G topi BALB / c che sono> 20 g. È importante sottolineare che, se si utilizzano i formati alternativi cateteri, aghi smussati devono essere di provenienza che si adattano il lume del catetere e sono tagliati ad una lunghezza che si estende appena 1 millimetro al di là della punta del catetere. Intubazione di topi di dimensioni inferiori a 17 g può essere possibile, ma non è raccomandato a causa della esperienza richiesta, e richiederebbe l'uso di cateteri più piccoli e specula che sono descritti in precedenza.
Abbiamo usato IMIT per la consegna di diversi patogeni respiratori oltre a P. aeruginosa, compresi B. pseudomallei 9 e Klebsiella pneumoniae 10. Il modello IMIT ha conseguito notevoli progressi per i nostri studi di B. malattie respiratorie pseudomallei, dopo aver individuato che l'inoculazione intranasale provoca un precoce, morbilità URT-correlata di topi piuttosto che l'endpoint malattia sistemica osservata nella malattia umana 9. B. pseudomallei è un Tier 1 Selecagente t di impatto biodefense, e come si stanno sviluppando tali, modelli di malattie respiratorie per l'esposizione di aerosol che modelli un biodefense correlato potenziale via di ingresso per patogeni come arma. Dato che i modelli attuali aerosol provocano l'infezione sia della URT e LRT, gli stessi potenziali fenotipi presto morbilità abbiamo individuato per il modello intranasale di B. malattie respiratorie pseudomallei può applicare al modello di aerosol. Un futuro adattamento del modello IMIT potrebbe essere una consegna di aerosol intubazione-mediata (IMAD), in cui i topi sono intubato per la consegna porta aerosol solo nel polmone. Ventilatori meccanici sono attualmente disponibili per mantenere l'anestesia isoflurano, che potrebbe essere adattato per fornire una, piuttosto che a base liquida, sfida patogeno aerosol.
IMIT stato sviluppato inizialmente come un approccio per ottimizzare l'erogazione dei batteri al polmone, ma ha anche un'applicazione per la consegna di altri reagenti nel polmone del mouse. Come disdiscussi sopra, consegna intranasale di composti in topi determina una bassa efficienza, consegna altamente variabile dei reagenti nell'organo bersaglio del polmone. Consegna intranasale di Positron Emission Tomography (PET) reagenti di imaging al polmone murino ha prodotto un rendimento di consegna del 40% 11, mentre abbiamo dimostrato che IMIT offre un'ottima alternativa per l'altra consegna del polmone si avvicina con il suo> 98% di efficacia consegna e la distribuzione multilobare. Questo miglioramento somministrazione mirata al polmone ha il potenziale per aumentare la riproducibilità di consegna terapeutico per il trattamento della malattia polmonare. IMIT simile potrebbe offrire vantaggi agli studi di: i) l'impatto delle sostanze irritanti polmonari ambientali, ii), del cancro del polmone studi fenotipici, iii) specifici siRNA-polmone knock-down.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful for the support from the Center for Predicative Medicine Animal Models (Carol Vanover, Ashley Biller and Jennifer Kraenzle) and Microbiology (Daniel Cramer and Julie Sotsky) Core Facilities. This work was supported by funding from the NIH (HHSN272201000033I to M.B.L and J.M.W.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC | 000A3467 | Base should be detached when working in a BSC |
| Operating Otoscope Head | Welch Allyn | 21700 | |
| Otoscope 3.5 V Li Battery | Welch Allyn | 71900 | |
| Mouse Intubation Specula short, Autoclaveable | Hallowell EMC | 200A3589S | |
| Incisor Loops | Hallowell EMC | 210A3490A | |
| Cotton fine tip applicator | Puritan | 871-PC DBL | Used for tongue retraction |
| I.V. Catheter, 20G | Exel Int | 26741 | Optional: fit a silicon sleeve with 10mm exposed catheter surface |
| Gas tight syringe, 250ul | Hamilton | 81120 | Used for delivery of liquid inoculum by IMIT |
| Blunt Needle, 22G | Hamilton | 91022 | Trim to length to protrude 1mm from 20G catheter |
| Guide wire (Fiber optic wire, 0.5mm) | TheFiberOpticStore.com | FOF .50 | Cut to 6" length: used as guide wire for intubation |
| Tuberculin syringe, 1ml | Becton Dickinson | 309659 | Assemble with fiber optic wire as guide wire |
| Brilliant Blue R (Coomassie) | Sigma | B0149 | |
| Tygon tubing, 1/16" | Saint Gobain | ALC00002 | |
| Male luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45503-22 | |
| Female luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45500-00 | |
| Lidocaine, USP | Spectrum | LI102 | pH lidocaine into solution at 2%(w/v) pH7.0 |
| Sample bag, 1oz | Whirl-Pak | B01067 | |
| U-bottom 96 well plate, sterile | Greiner | 650161 |
References
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