挿管媒介気管内（IMIT）点眼：非侵襲的、肺特異的送達システム

注：ここで説明する手順のすべてが見直され、大学、ルイビルの制度バイオセーフティ委員会（プロトコル＃13から056）と、施設内動物管理使用委員会（プロトコル＃13から064）によって承認された。 染料の調製 0.45μMのシリンジフィルターを用いて滅菌PBSクマシーブリリアントブルー及びフィルタ（w / v）の0.1％に希釈する。 緑膿菌文化の調製 15時間点滴の前に、単一の細菌コロニーをブロス培養の3ミリリットルを接種する。 シェーカー（200 rpm）の上で37℃で培養する15時間を育てる。 遠心分離機30秒1.5mlマイクロチューブ12000×gの中の文化の1ミリリットル。 培地を除去し、PBS 1ml中ペレットを再懸濁。 PBS中の細菌ストック懸濁液1:10アリコートを希釈し、決定するために、希釈した細菌懸濁液のOD 600を測定する細菌濃度。 IMIT接種のために50μlの配信ボリュームを使用して、細菌接種の所望の濃度にPBS中の細菌ストック懸濁液を希釈する。 3. IMIT点眼イソフルラン麻酔導入チャンバーにマウスの群を配置し、2を用いた麻酔 – 3％イソフルラン/酸素混合物を。 鎮静の初期開始時に、直立マウスを保持し、マウスを首筋、そして喉の奥まで強制経口投与針によって2％リドカイン溶液10μlを投与し、その溶液がダウン喉頭蓋へ排出させる。麻酔室にマウスを返します。 局所麻酔薬としての完全な効果を取るためにリドカインを可能にするために、5分間の最小値を許可します。 マウスは鎮静の所望のレベル（〜60 BPMの呼吸数）を達成したら、鎮静を維持するために、2％イソフルランを減らす。 250μlの気密に染料または細菌接種をプリロード22 Gの長い鈍針付き精密シリンジフィット。 第1のシリンジのテフロンプランジャによって測定された空気を150μlを、策定。次に、注射器本体に200μlのマークに150μlのマークからテフロンプランジャーを前進させることによって、接種物50μlのを策定。 注：サンプルは挿管マウスに排出されると、50μlの懸濁液は、肺全体に接種物を配布します150μlのエアクッションが続き、最初に配信されます。 誘導室から一匹のマウスを取り外し、挿管プラットフォーム上で仰臥横たわっていた。マジックテープに付着したOリングとの切歯をフックし、プラットフォームにベルクロを固定することによって、プラットフォームにマウスを固定します。 45°傾斜にマウスを持ち上げます。 マイクロ綿棒を使用して、利き手を使用して、ローリング運動と舌を引っ込める。 非優位手で両方のMAへ挿管検鏡で動作耳鏡フィットを使用舌後退intainと声門を視覚化。 利き手で、マウスの気管（カテーテルが露出し、カテーテルの10ミリメートルのシリコンスリーブ付きフィット）に10ミリメートルの深さまでカテーテル、シーティングマウスを挿管する20のGカテーテルに通し、ガイドワイヤーを使用しています。耳鏡/検鏡を削除します。 マウスが正しく簡単に着色された染料を含む1/16「クリアチューブのルアー接続長さを装着しながら、非優位手でカテーテルを固定することにより、挿管されたことを確認します。 NOTE：染料が急速に呼吸に応じて前後に移動する。 挿管の確認はこの時点で確立されていない場合、その後のステップに進まないでください。挿管が失敗した実行し​​ようとした場合、挿管一つの追加の試みのためのカテーテル、ガイドワイヤをリセットします。 注：マウスの​​外傷を引き起こすことなく、1つのセッションでのマウス二つ以上の挿管を試みるunadvisableある。 に進みます液体懸濁液/エアクッションを含む精密シリンジ/ブラント針を挿入しながら、非優位手でカテーテルを固定します。 単一の流体運動で直接肺への液体/空気を分配し、すぐにマウスから針/カテーテルを取り除く。 ケージにマウスを返し、麻酔からの回復を可能にする。 IMT配信の4キャラクタリゼーション IMIT点滴注入した後、適切な時間、接種後のCO 2窒息によりマウスを安楽死させる。 解剖ボードに安楽死させたマウスを保護し、噴出ボトルを使用し、70％EtOHで胸と腹部を浸す。 肺全体の造影剤の分布を評価する場合は、無菌技術を用いて動物から肺を除去し、画像化に適するように肺を表示する。 注：肺は、適切な固定または凍結保存を通じて追加的な組織学的染色技術のために調製することができる<。/ LI> 感染した肺組織の細菌負荷を評価する場合は、無菌技術を用いた動物から肺を取り出します。無菌に肺を置き、1オンスサンプルバッグを予め秤量。計量し、サンプルバッグ+肺の重量を記録します。 各サンプルバッグ+組織への滅菌1×PBSの1ミリリットルを追加します。サンプルバッグを再シール。 サンプルバッグ+組織上の25ミリリットルの血清学的ピペットを圧延することにより穏やかな組織を均質化する。 シリアル寒天プレート上の滅菌PBSおよびプレート内の肺ホモジネートの希釈液（LB、または検討されて細菌種への適切な）を生成します： その後、寒天プレート上でマルチチャンネルによる三連のサンプルをプレートマルチチャンネルピペッターによるU底96ウェルプレート中で6倍連続希釈を行っています。 37℃にて一晩寒天プレートをインキュベートし、翌日のコロニー形成単位を列挙。