Entübasyon-aracılı intratrakeal (IMIT) damlatma: A Noninvaziv, Lung-özel Dağıtım Sistemi
Summary
Reaktiflerin Entübasyon aracılı intratrakeal (IMIT) instilasyon solunum yolu hastalıkları, hem de akciğer içine doğrudan tedavi reaktifler aşılamak için bir yöntem incelenmesi için mükemmel, invazif olmayan bir yöntemdir. Bu klinik öncesi test için uygun bir hızlı ve yüksek oranda çoğaltılabilir bir yöntemdir.
Abstract
Solunum hastalığı çalışmalar tipik vekil sistemleri gibi fare modellerinin kullanımını içerir. Bununla birlikte, özellikle üst solunum yollarının (ÜRT) 'de murin ve insan solunum yolu şekli bir çok fizyolojik farklılıklar vardır. Potansiyel olarak, bu hastalıklar çalışma fare modeli olan faydalılığı sınırlandırmakta, burun içi instilasyon teknikler kullanılarak Bazı modellerde, murin burun boşluğunda bu farklılıklar, alt solunum yolunun (MDT), hastalığın ilerlemesi ve sunum üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Bu nedenlerden dolayı, RBB tutulumu yokluğunda lrt hastalığı araştırmak amacıyla, farenin akciğerlerinde doğrudan bakteri aşılamak için bir tekniğin geliştirilmesi de avantajlı olacaktır. Biz bu akciğer özel uygulama tekniği entübasyon-aracılı intratraşel (IMIT) instilasyonunu tabirinin. Bu yöntem ile daha invaziv nda geleneksel sırasında oluşabilecek kan, damlatma için potansiyeli en aza indirirÖnal cerrahi intratrakeal enfeksiyon yaklaşımlar ve arızi sindirim sistemi teslim olasılığını sınırlar. IMIT farelerin akciğerine bakterilerin doğrudan dağıtım aracılık katetere, kör bir iğne sokulması ile, soluk borusu içine doğru bir kateter yerleştirme sağlamak için bir ara adım, entübe takip edildiği, bir, iki aşamalı bir işlemdir. Bu yaklaşım, akciğerlerde reaktifi mükemmel dağılımı ile akciğerlere, bir teslimat> 98% etki kolaylaştırır. Bu nedenle, IMIT insan solunum yolu hastalığı araştırmak için belirteci olarak fareler kullanma yeteneği üzerine iyileştirilmesi, doğrudan akciğere lrt hastalık ve tedavi teslim incelemek için yeni bir yaklaşımı temsil etmektedir. Ayrıca, bu iletim sisteminin doğru ve tekrarlanabilirliği de Good Laboratory Practice Standartları (LU) için uygun, hem de akciğer yüksek verim gerçekleştirilmesini gerektiren reaktifler geniş bir iletim yapar.
Introduction
Fareler, solunum hastalıklarının bir sayısız da dahil olmak üzere çok sayıda insan hastalık açıklamalarını modellemek için kullanılmıştır. Yedek hastalık modelleri genellikle tipik olarak önemli fizyolojik veya iki konak modellerinde immün farklılıklar nedeniyle, bir modellenen hastalığın tüm yönlerini özetlemek mümkün değildir. Böylece, model sistemlerinin iyileştirilmesi bir gol suretler daha yakından bir hastalık sürecini ayna veya özgün ana bilgisayar sisteminde görüldüğü gibi yanıt ev sahipliği yapmaya izin yaklaşımlar geliştirmektir. Onlar havasını hangi mekanizma fareler ve insanlar arasında birçok önemli fizyolojik farklılıklar vardır. URT ve LRT boyutları arasında anlamlı rasyometrik farklılıkların bu farklar bulunuyor. Bu fareler> 100 toplam akciğer kapasitesi 1,2 karşı normalize insanlara ÜRT yüzey alanı, kat sahip olduğu tahmin edilmiştir. Bu durumda, fare konka breathi çok daha büyük bir oranını teşvik etmek için solunan havanın çok daha geniş bir filtreleme için izinburun boşluğunun enfeksiyon hastalığın ilerlemesinde önemli bir rol oynar eğer ng, pnömoni çalışmaları üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir.
Çeşitli yaklaşımlar insan gibi solunum yolu hastalığı araştırmak için, farelerin ciğerlerine bakterileri aşılamak için kullanılmıştır. Bu yaklaşımlardan en çok sıvı bir süspansiyon, bir fare, bir ya da her iki burun tatbik edildiği intranazal aşılama vardır. Nispeten basit iken, burundan aşılamadan 3-5 yoluyla lrt damlatma verimliliğini etkileyebilir kullanılan anestezinin damlatılması hacmi ve türü olarak uyarılar. Spesifik olarak, Miller ve diğ. en az 50 ul lrt 6 içine bakteri damlatma ile sonuçlanmadı hacimlerde, Francisella tularensis bu burun içi instilasyon göstermiştir. Anestezi için enjekte ketamin / ksilizin karşıt olarak inhale izofluran kullanırken Onlar daha iyi lrt instilasyonunu gözlendi. Ancak, ExperiencYersinia pestis, intranazal aşılama e izofluran (MBL, yayınlanmamış veriler) kıyasla daha tutarlı bir aşı, ketamin / ksilazin kullanılarak elde edilebilir gösterir. Bu farklılıklar kullanılan patojene veya laboratuar prosedürlerinde, çeşitlilikten dolayı, ama önemlisi bu teknikte olası değişkenliği vurgulamak atfedilebilir. Bundan başka, başlangıç bakteriyel inokulum nispeten düşük bir yüzdesi ciğere erişmesi burun içi instilasyon göstermektedir kısa bir süre sonra hasat akciğerlere bakterilerin büyük sayıda düşündüren (Y. pestis durumunda, sadece% 10 instilasyon 7 1 saat sonra elde edildi) RBB olarak muhafaza edilir (veya mide-barsak kanalında Yutulan) olabilir. Organizma, insan hastalığı ile tutarlı bir şekilde, sıçangil burun boşluğunu kolonize edebilen ise, bazı hastalık modellerinde, ÜRT mukoza bakteri, bu önemli bir çökelme hastalığın ilerlemesinin anlamamıza karıştırıcı etki. Örneğin, in vivo kullanımı </ Em> görüntüleme, bu burun içi instilasyon yöntemiyle 8 ile iletildikleri zaman, insan urt kolonize etmez Burkholderia pseudomallei, sıçangil burun boşluğunun ezici fırsatçı enfeksiyonlara neden olduğu gözlenmiştir.
Farelerin ciğerlerine bakterilerin aşılanması için diğer yöntemler de enfeksiyonlu hastalık araştırmalarında kullanılmıştır. Transoral [sindirim sistemi ve LRT]; ancak, burun damlatılması ile karşılaştırıldığında bu yöntemler çoklu siteleri (örneğin, aerosol [URT ve LRT] enfeksiyon başlatılması için potansiyelini ortadan kaldıracak olmadan daha fazla teknik uzmanlık ve / veya pahalı ekipman gerektiren eğilimindedir ve cerrahi intratraşel [LRT ve kan akışı]). Enfeksiyonun ikincil siteleri ile ilişkili olabilecek olası komplikasyonları göz önüne alındığında, biz UrT atlar ve doğrudan anestezi farelerin ciğerlerine patojeni sunan bir intratraşel yaklaşım geliştirmeye çalıştılar, ama aynı zamanda yanlışlıkla inoculat sınırlarKan akımı veya GI kanalı içine iyon. Bu amaçla, entübasyon-aracılı intratraşel (IMIT) damlatılması önce damlatılmasını uygun kateter yerleştirme doğrulamak için bir ara adım ekleyerek inokulum lrt instilasyonunu garanti cerrahi olmayan bir prosedür olarak geliştirilmiştir. Görsel akciğerlerde inokulum geniş dağılımını göstermektedir, ve P. Bu yöntem, boya instilasyonunu kullanılarak tarif edilmektedir aeruginosa, instilasyon akciğere Bu yöntemin oldukça etkili teslimatı (> aşı% 98) gösterdi. Önemli olarak başlangıçta bakteriyel verilmesi için geliştirilmiş olup, IMIT de için etkin bir araç sunmaktadır: diğer solunum yolu hastalığı modellerinde ii) 'ın özel terapötik teslimat çalışma için çeşitli moleküllerin i) damlatma ve iii) bazik akciğer fonksiyon testleri, hedef dahil akciğere siRNA teslimat.
Protocol
Representative Results
Discussion
IMIT İnstilasyon tekrarlanabilir akciğere doğrudan reaktifleri aşılamak için yeteneği var olan solunum hastalığı modellerinde yönelik önemli geliştirmeler sunuyor. Bu IMIT tekniği gerçekleştirir ideal anestezi ve caging lojistik yöneten biri iki araştırmacı, bir takım için ideal bir hızlı yaklaşım ve diğeri. Fare başına 3 dakika – Büyük çalışmaları 2 ortalama süresi taahhüdü ile IMIT kullanılarak yapılabilir. Yaklaşım bir anestezik olarak izofluran kullanımını kolaylaştırır, çünkü, fareler geri kazanımı yoluyla hayvanları izleme hayvancılık süresini azaltarak, anestezi hızla iyileşir.
IMIT yönteminin teknik açıdan en zor yönü fareler entübasyon ilk adımıdır. IMIT gerçekleştirmek için öğrenme Bireyler bu ilk kateter yerleştirilmesi aşamasında ve entübasyon sağlanması boya hareketin görsel onay yoluyla elde edilmiştir odaklanmak edebiliyoruz. Yaklaşımın faydası akciğer-spectüpte İnstilasyon yeni araştırmacı hem güvenini hem de zor bir hayvan entübe girişiminde uzman artar entübasyon teyidi kullanımı ile garanti edilmektedir. Başarılı entübasyon olasılığını optimize kilit unsurları şunlardır: Bir derin sedasyon elde i), ii) ağızda Spekül doğru yerleştirme iii) iyi derinlik yerleştirme, epiglot iyi görselleştirme izin için yeterli çalışma süresi sağlamak için aynaları dil işlem boyunca geri kalır, ve prosedür, rahat ve sürekli bir yaklaşım ile yapılır ve böylece, devirme platformun iv) kullanımı araştırmacının el destek böylece.
IMIT prosedürün sınırlamalar biri IMIT instilasyon etkinlikleri frekansı ile ilişkilidir. Cevapsız entübasyon ile ilişkili potansiyel travma nedeniyle, ikiden fazla entübasyon girişimleri (iki isabetsizlik için) tek oturumda yapılan tavsiye edilmez. IMITkabiliyeti mükemmel bir potansiyel murin akciğer içine terapötik sağlamak için kullanılacak olan, akciğere reajanı çok sık teslimat yararlanabilir Ancak terapötik rejimler IMIT için uygun olmayabilir. Bu IMIT önemli bir travma olmaksızın bir murin akciğer içine reaktifleri teslim etmek için günlük olarak kullanılabilecek bu mümkün olabilir, ancak entübasyon bağlantılı travma çoğunda olduğu gibi, yüksek vasıflı bir araştırmacı tarafından yapılan yalnızca kaçırılmış entübasyon olayla ilişkili olduğu düşünülmektedir . Bu tür yüksek frekanslı IMIT yerel veteriner hekimler ve IACUC ile ele alınmalıdır.
IMIT ek bir potansiyel bir sınırlama entübe olan fare boyutudur. 20 G kateter Bu aralıktaki değerlere sahip farelerin trakea için uygun bir boyutta olduğu bulunmuştur 22 g, – yukarıda tarif edilen IMIT prosedürü yaklaşık 17 fareleri kullanılarak geliştirilmiştir. Büyük kateterler başarılı yaşlı farelerin kullanılmıştır; IMIT m ilk geliştirme> 20 gr arasındadır, BALB / c farelerinde bir 18 G kateter ade kullanımı. Alternatif bir kateter boyutlar kullanılıyorsa da önemlisi, küt iğne kateter lümeni uygun ve sadece kateter ucu ötesine 1 mm uzanan bir uzunluğa kesilmiş olan kaynaklı olmalıdır. 17 g'dan küçük farelerin Entübasyon mümkün olabilir, fakat gerekli uzmanlık nedeniyle tavsiye edilmez, ve daha küçük kateter ve yukarıda tarif edilen daha Spekül kullanımını gerektirecektir.
P. ek olarak birçok solunum patojenlerin verilmesi için IMIT kullandık B. dahil aeruginosa, pseudomallei 9 ve Klebsiella pneumoniae 10. IMIT Model B çalışmalarımız önemli ilerlemeler kaydetmiştir pseudomallei solunum hastalığı, burun aşılama yerine insan hastalığında 9 gözlenen sistemik hastalık bitiş daha farelerin erken, ÜRT-ilişkili morbiditeye neden olduğu tespit sahip. B. pseudomallei Tier 1 selec olduğunubiyosavunma etki t madde, ve, solunum hastalık modelleri Aerosol çıkarmasından için geliştirilmektedir gibi olan modeller silaha patojen için giriş potansiyel biyosavunma ilgili yol. Mevcut aerosol modelleri RBB ve lrt hem de enfeksiyona neden için, aynı potansiyel erken hastalık fenotipi, B. göre olan burun içi model belirledik pseudomallei solunum hastalığı aerosol model için geçerli olabilir. IMIT modelinin bir gelecek uyarlama farelerin sadece akciğer içine hedef Aerosol uygulaması için entübe edildiği entübasyon aracılı aerosol yoluyla (IMAD) olabilir. Mekanik fanlar aerosollaştınlmış, sıvı bazlı ziyade, patojen meydan sunmak için adapte olabilir izofluran anestezisi, korumak için şu anda kullanılabilir.
IMIT akciğere bakterilerin iletimini optimize etmek için bir yöntem olarak, başlangıçta gelişmiş değil, aynı zamanda, fare akciğer içine, diğer reaktifler verilmesi için uygulama sahiptir. Dis olarakyukarıda ele alınan, düşük verimlilik farelerde terkiplerin burun içinden sağlanması, akciğerlerin hedef organı içine reaktiflerin son derece değişken teslimat. Biz IMIT olarak>% 98 dağıtım etkinlik ve multilober dağılımına sahip yaklaşımları için diğer akciğere verilme için mükemmel bir alternatif olduğunu göstermiştir, oysa sıçangil akciğere Pozitron Emisyon Tomografisi (PET) görüntüleme reaktifleri burun içinden sağlanması,% 40 iletim verimliliği 11 elde edildi. Akciğere hedeflenen bir gönderim bu gelişme solunum hastalığının tedavisi için terapötik teslimat tekrarlanabilirliğini artırma potansiyeline sahiptir. I) Çevre akciğer tahriş edici etkisi, ii) akciğer kanseri fenotipik çalışmalar, iii) akciğer özgü siRNA knock-down: IMIT benzer çalışmaları fayda sunabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful for the support from the Center for Predicative Medicine Animal Models (Carol Vanover, Ashley Biller and Jennifer Kraenzle) and Microbiology (Daniel Cramer and Julie Sotsky) Core Facilities. This work was supported by funding from the NIH (HHSN272201000033I to M.B.L and J.M.W.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC | 000A3467 | Base should be detached when working in a BSC |
| Operating Otoscope Head | Welch Allyn | 21700 | |
| Otoscope 3.5 V Li Battery | Welch Allyn | 71900 | |
| Mouse Intubation Specula short, Autoclaveable | Hallowell EMC | 200A3589S | |
| Incisor Loops | Hallowell EMC | 210A3490A | |
| Cotton fine tip applicator | Puritan | 871-PC DBL | Used for tongue retraction |
| I.V. Catheter, 20G | Exel Int | 26741 | Optional: fit a silicon sleeve with 10mm exposed catheter surface |
| Gas tight syringe, 250ul | Hamilton | 81120 | Used for delivery of liquid inoculum by IMIT |
| Blunt Needle, 22G | Hamilton | 91022 | Trim to length to protrude 1mm from 20G catheter |
| Guide wire (Fiber optic wire, 0.5mm) | TheFiberOpticStore.com | FOF .50 | Cut to 6" length: used as guide wire for intubation |
| Tuberculin syringe, 1ml | Becton Dickinson | 309659 | Assemble with fiber optic wire as guide wire |
| Brilliant Blue R (Coomassie) | Sigma | B0149 | |
| Tygon tubing, 1/16" | Saint Gobain | ALC00002 | |
| Male luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45503-22 | |
| Female luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45500-00 | |
| Lidocaine, USP | Spectrum | LI102 | pH lidocaine into solution at 2%(w/v) pH7.0 |
| Sample bag, 1oz | Whirl-Pak | B01067 | |
| U-bottom 96 well plate, sterile | Greiner | 650161 |
References
- Reznik, G. K. Comparative anatomy, physiology, and function of the upper respiratory tract. Environ Health Perspect. 85, 171-176 (1990).
- Hoyt, R. F. J., Hawkins, J. V., St. Clair, M. B., Kennet, M. B., Fox, J. G., et al. Chapter 2. The Mouse in Biomedical Research, Volume 2, Second Edition: Diseases (American College of Laboratory Animal Medicine). 2, 23-90 (2007).
- Visweswaraiah, A., Novotny, L. A., Hjemdahl-Monsen, E. J., Bakaletz, L. O., Thanavala, Y. Tracking the tissue distribution of marker dye following intranasal delivery in mice and chinchillas: a multifactorial analysis of parameters affecting nasal retention. Vaccine. 20, 3209-3220 (2002).
- Eyles, J. E., Spiers, I. D., Williamson, E. D., Alpar, H. O. Tissue distribution of radioactivity following intranasal administration of radioactive microspheres. J Pharm Pharmacol. 53, 601-607 (2001).
- Southam, D. S., Dolovich, M., O’Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 282, 833-839 (2002).
- Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS ONE. 7, (2012).
- Lathem, W. W., Crosby, S. D., Miller, V. L., Goldman, W. E. Progression of primary pneumonic plague: a mouse model of infection, pathology, and bacterial transcriptional activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17786-17791 (2005).
- Warawa, J. M., Long, D., Rosenke, R., Gardner, D., Gherardini, F. C. Bioluminescent diagnostic imaging to characterize altered respiratory tract colonization by the Burkholderia pseudomallei capsule mutant. Front Microbiol. 2, 133 (2011).
- Gutierrez, M., Pfeffer, T. L., Warawa, J. M. Type 3 Secretion System cluster 3 is a critical virulence determinant for lung-specific melioidosis. Submitted. , (2014).
- Fodah, R. A., et al. Correlation of Klebsiella pneumoniae comparative genetic analyses with virulence profiles in a murine respiratory disease model. PLoS ONE. In revision, (2014).
- Soto-Montenegro, M. L., et al. Assessment of airway distribution of transnasal solutions in mice by PET/CT imaging. Mol Imaging Biol. 11, 263-268 (2009).
