بوساطة التنبيب داخل الرغامى (IMIT) تقطير: وموسع والرئة محدد نظام تسليم
Summary
التنبيب داخل الرغامى بوساطة (IMIT) تقطير الكواشف هو، طريقة ممتازة موسع لدراسة أمراض الجهاز التنفسي، وكذلك وسيلة لغرس الكواشف العلاجية مباشرة في الرئة. انها طريقة سريعة وقابلة للتكرار للغاية والتي هي مناسبة لاختبار قبل السريرية.
Abstract
تشمل دراسات أمراض الجهاز التنفسي عادة استخدام نماذج الفئران إلى أنظمة بديلة. ومع ذلك، هناك اختلافات فيزيولوجية كبيرة بين الفئران والإنسان الجهاز التنفسي، وخصوصا في المجاري التنفسية العليا من (جمهورية تنزانيا المتحدة). في بعض النماذج، يمكن لهذه الاختلافات في تجويف الأنف الفئران يكون لها تأثير كبير على تطور المرض والعرض في الجهاز التنفسي السفلي (LRT) عند استخدام تقنيات تقطير الأنف، يمكن أن يحد من فائدة نموذج الفأر لدراسة هذه الأمراض. لهذه الأسباب، قد يكون من المفيد لتطوير تقنية لغرس البكتيريا مباشرة إلى الرئتين الماوس من أجل دراسة مرض LRT في غياب إشراك جمهورية تنزانيا المتحدة. لقد وصف هذا تحديدا داخل الرغامى بوساطة التنبيب-تقنية التوصيل (IMIT) تقطير الرئة. هذه التقنية موسع يقلل من إمكانية تقطير في مجرى الدم، والتي يمكن أن تحدث أثناء traditi أكثر الغازيةالجراحية النهج اونال داخل القصبة الهوائية العدوى، ويحد من إمكانية عرضية تسليم الجهاز الهضمي. IMIT هي عملية من خطوتين التي يتم فيها مدخل أنبوب الفئران أولا، مع خطوة وسيطة لضمان وضع القسطرة الصحيح في القصبة الهوائية، تليها إدخال إبرة حادة في القسطرة للتوسط النقل المباشر للبكتيريا في الرئة. هذا النهج يسهل فعالية> 98٪ من الولادة إلى الرئتين مع توزيع ممتاز للكاشف في جميع أنحاء الرئة. وبالتالي، يمثل IMIT نهج رواية لدراسة مرض LRT وتقديم العلاج مباشرة إلى الرئتين، على تحسين القدرة على استخدام الفئران كبديل لدراسة أمراض الجهاز التنفسي البشري. وعلاوة على ذلك، فإن دقة واستنساخ هذا النظام يجعل من التسليم أيضا قابلة للمعايير الممارسة المعملية الجيدة (GLPS)، فضلا عن تقديم مجموعة واسعة من المواد الكيميائية التي تتطلب تسليم كفاءة عالية إلى الرئة.
Introduction
وقد تم استخدام الفئران لنموذج العديد من مظاهر الأمراض البشرية، بما في ذلك عدد لا يحصى من أمراض الجهاز التنفسي. نماذج بديلة المرض غالبا ما تكون غير قادرة على تلخيص كل جوانب مرض نمذجتها، عادة بسبب فيزيولوجي مهم أو الاختلافات المناعية في نماذج المضيف اثنين. وهكذا، فإن هدف تحسين أنظمة النموذج هو لتطوير المناهج التي تتيح بدائل لتعكس عن كثب عملية المرض أو استجابة استضافة كما لوحظ في النظام المضيف الأصلي. هناك العديد من الاختلافات الفسيولوجية الرئيسية بين الفئران والبشر في الآلية التي كانت مصدر إلهام الهواء. المدرجة في هذه الاختلافات هي اختلافات كبيرة في حجم ratiometric بين جمهورية تنزانيا المتحدة وLRT. وتشير التقديرات إلى أن الفئران تمتلك> 100 أضعاف مساحة جمهورية تنزانيا المتحدة المتعلقة البشر، ضد تطبيع الكلي 1،2 قدرة الرئة. وبالتالي، المحارات الأنفية من الفأرة تسمح لتصفية أكثر اتساعا من الهواء من وحي لتسهيل بمعدل أكبر بكثير من breathiنانوغرام، والتي قد يكون لها تأثير كبير على الدراسات الالتهاب الرئوي اذا إصابة تجويف الأنف يلعب دورا هاما في تطور المرض.
وقد استخدمت عدة أساليب مختلفة لغرس البكتيريا في الرئتين من الفئران لدراسة أمراض الجهاز التنفسي مثل الإنسان. الأكثر شيوعا من هذه الأساليب هو التلقيح داخل الأنف، حيث يتم تطبيق وقف السائل في واحد أو كلا فتحتي الأنف على فأرة الحاسوب. في حين بسيطة نسبيا، والمحاذير مثل تقطير حجم ونوع التخدير المستخدم يمكن أن تؤثر على كفاءة تقطير في LRT عن طريق التلقيح داخل الأنف 3-5. على وجه التحديد، ميلر وآخرون. قد أظهرت أن تقطير داخل الأنف من الفرنسيسيلة التولارية بكميات لم أقل من 50 ميكرولتر لا يؤدي إلى تقطير من البكتيريا في LRT 6. انهم وحظ كذلك أفضل LRT تقطير عند استخدام الأيزوفلورين المستنشق بدلا من حقن الكيتامين / زيلازين للتخدير. ومع ذلك، لدينا التجربهه مع يرسينيا بيستيس التلقيح داخل الأنف يشير يمكن أن يتحقق التلقيح أكثر اتساقا استخدام الكيتامين / زيلازين بالمقارنة مع الأيزوفلورين (MBL، بيانات غير منشورة). ويمكن أن يعزى هذا الاختلاف إلى الممرض أو استخدامها لاختلاف في الإجراءات المخبرية، ولكن الأهم تسليط الضوء على التغير المحتمل في هذه التقنية. وعلاوة على ذلك، الرئتين تحصد بعد عرض الأنف تقطير أن نسبة منخفضة نسبيا من اللقاح البكتيري الأولي تصل إلى الرئة قريبا (في حالة Y. الطاعون، تم انتشال 10٪ فقط 1 ساعة بعد تقطير 7)، مما يشير إلى أن عددا كبيرا من البكتيريا يمكن الاحتفاظ بها في جمهورية تنزانيا المتحدة (أو ابتلع في الجهاز الهضمي). في نماذج معينة المرض، وهذا الترسب كبير من البكتيريا على الغشاء المخاطي تنزانيا المتحدة قد تربك فهمنا لتطور المرض إذا كان الكائن قادر على استعمار تجويف الأنف الفئران بطريقة لا تتفق مع الأمراض التي تصيب البشر. على سبيل المثال، استخدام في الجسم الحي </ EM> التصوير، وقد لوحظ أن بوركهولدريا الراعومية، والتي لا استعمار URT الإنسان، ويسبب العدوى الانتهازية الساحقة من تجويف الأنف عند الفئران التي ألقاها الأنف طريقة تقطير 8.
كما تم استخدام طرق أخرى لزرع البكتيريا في الرئتين من الفئران في بحوث الأمراض المعدية. ومع ذلك، بالمقارنة مع الأنف تقطير هذه الطرق تميل الى تتطلب خبرة أكثر تقنية و / أو معدات باهظة الثمن دون أن يلغي احتمال بدء العدوى في مواقع متعددة (على سبيل المثال، الهباء الجوي [URT وLRT]، [transoral الجهاز الهضمي وLRT]، وداخل الرغامى الجراحية [LRT ومجرى الدم]). نظرا للمضاعفات المحتملة التي يمكن أن تكون مرتبطة مع مواقع ثانوية للعدوى، سعينا إلى وضع نهج داخل القصبة الهوائية التي تتجاوز تنزانيا المتحدة ويسلم الممرض مباشرة إلى الرئتين من الفئران تخدير، ولكن أيضا يحد inoculat غير مقصودايون في مجرى الدم أو الجهاز الهضمي. لتحقيق هذه الغاية، وضعت بوساطة التنبيب داخل الرغامى (IMIT) تقطير كإجراء غير الجراحية التي تضمن LRT تقطير اللقاح من قبل بما في ذلك خطوة وسيطة للتحقق من وضع القسطرة السليم قبل تقطير. ويوصف هذا الأسلوب باستخدام صبغة تقطير لإظهار بصريا التوزيع الواسع للاللقاح في جميع أنحاء الرئة، وP. الزنجارية تقطير لإثبات تسليم فعال للغاية (> 98٪ من اللقاح) من هذا الأسلوب إلى الرئة. الأهم من ذلك، في حين وضعت أصلا للتسليم البكتيري، IMIT كما يقدم أداة فعالة ل: ط) تقطير من مختلف الجزيئات لدراسة النماذج الأخرى مرض في الجهاز التنفسي، والثاني) تسليم العلاجية الرئة محددة، والثالث) دراسات وظائف الرئة الأساسية، بما في ذلك استهداف تسليم سيرنا إلى الرئة.
Protocol
Representative Results
Discussion
IMIT تقطير يقدم تحسينات رئيسية لأمراض الجهاز التنفسي النماذج الموجودة في القدرة على غرس بتكاثر الكواشف مباشرة في الرئة. وهو النهج السريع الذي يقع بشكل مثالي لفريق من اثنين من الباحثين، واحدة من التي تدير الخدمات اللوجستية التخدير والحبس، والآخر الذي يؤدي تقنية IMIT. قد يتم إجراء دراسات كبيرة باستخدام IMIT بمتوسط التزام وقت من 2 – 3 دقيقة لكل الماوس. لأن النهج يجعل من استخدام الأيزوفلورين كمخدر، الفئران على التعافي بسرعة من التخدير، وتقليل الوقت وتربية الحيوانات من خلال رصد الانتعاش.
الجانب الأكثر تحديا من الناحية التقنية من طريقة IMIT هو الخطوة الأولى لتنبيب الفئران. تعلم الأفراد لأداء IMIT قادرون على التركيز على هذه الخطوة الأولى من وضع القسطرة والتأكد من أن التنبيب تم تحقيقه من خلال التأكيد البصري للحركة الصبغة. صالح النهج هو أن الرئة المواصفاتمكفول IFIC تقطير من خلال استخدام تأكيد التنبيب، مما يزيد من ثقة كل من الباحث الجديد وكذلك الخبير محاولة تدخله حيوان الصعب. العناصر الرئيسية لتحقيق الاستفادة المثلى من احتمال وجود التنبيب ناجحة هي: ط) تحقيق التخدير العميق لإتاحة الوقت الكافي العمل، والثاني) موضع الصحيح للمناظير في الفم للسماح التصور الجيد لسان المزمار والثالث) التنسيب عمق جيد لل مناظير بحيث يظل اللسان تراجع في جميع أنحاء الداخلي، والرابع) استخدام منصة إمالة لدعم أيدي الباحث بحيث يتم إجراء الإجراء استرخاء مع وجود نهج ثابت.
واحد من أوجه القصور في إجراءات IMIT يرتبط تواتر الأحداث IMIT تقطير. بسبب الصدمة المحتملة المرتبطة مع التنبيب غاب، فمن غير المستحسن أن يتم إجراء أكثر من محاولتين التنبيب في جلسة واحدة (ما يصل الى اثنين يخطئ). IMITوقد إمكانات ممتازة في قدرته على استخدامها لتوصيل العلاجات إلى رئة الفئران، لكن الأنظمة العلاجية التي تستفيد من تسليم متكررة جدا من كاشف في الرئة قد لا تكون مناسبة لIMIT. قد يكون من الممكن أن IMIT يمكن استخدامها يوميا لتوفير الكواشف إلى رئة الفئران دون أن تسبب صدمة كبيرة، ولكن فقط عندما أجراه باحث من ذوي المهارات العالية، حيث أن الغالبية العظمى من الصدمة المرتبطة مع التنبيب ويعتقد أن تترافق مع حدث التنبيب غاب . ينبغي مناقشة هذا IMIT عالية التردد مع الأطباء البيطريين المحليين وIACUC.
قيود محتملة إضافية من IMIT هو حجم الفأر الذي يجري مدخل أنبوب. وقد وضعت إجراءات IMIT المذكورة أعلاه باستخدام الفئران حوالي 17-22 غرام، حيث تم العثور على 20 G قسطرة أن تكون ذات حجم مناسب لالقصبة الهوائية من الفئران في هذا النطاق الحجم. وقد استخدمت القسطرة بنجاح أكبر في الفئران الأكبر سنا. التطوير الأولي من IMIT ماستخدام أدي لقسطرة G 18 في BALB / ج الفئران التي هي> 20 غراما. الأهم من ذلك، إذا استخدمت أحجام قسطرة بديلة يجب ان تؤخذ الإبر كليلة والتي تناسب تجويف القسطرة ويتم قطع على طول 1MM الذي يمتد أبعد من مجرد غيض القسطرة. التنبيب من فئران أصغر من 17 ز قد يكون ممكنا ولكن لا ينصح نظرا للخبرة المطلوبة، ويتطلب استخدام القسطرة الصغيرة ومناظير من تم وصفها أعلاه.
وقد استخدمنا IMIT لإيصال عدة مسببات الأمراض في الجهاز التنفسي بالإضافة إلى P. الزنجارية، بما في ذلك B. الراعومية 9 و 10 كليبسيلا الرئوية. جعلت نموذج IMIT إنجازات هامة لدراساتنا من B. الراعومية أمراض الجهاز التنفسي، بعد أن حددت أن التلقيح داخل الأنف يسبب المبكر والاعتلال تنزانيا المتحدة ذات الصلة من الفئران بدلا من نقطة النهاية الأمراض الجهازية التي لوحظت في الأمراض التي تصيب البشر 9. ب. الراعومية هو الشق 1 SELECر عامل التأثير الدفاع البيولوجي، وكما يجري تطوير هذه النماذج أمراض الجهاز التنفسي التعرض للرذاذ الذي نماذج طريقا الدفاع البيولوجي ذات الصلة المحتملة لدخول الجراثيم إلى سلاح. لأن النماذج الحالية الهباء الجوي تؤدي إلى إصابة كل من جمهورية تنزانيا المتحدة وLRT، نفس الظواهر المحتملة في وقت مبكر الاعتلال حددنا لنموذج الأنف من B. قد تنطبق أمراض الجهاز التنفسي الراعومية لنموذج الهباء الجوي. والتكيف المستقبلي للنموذج IMIT يمكن أن يكون تسليم الهباء الجوي بوساطة التنبيب (عماد)، والتي هي مدخل أنبوب الفئران لتسليم الهباء هدف فقط في الرئة. تتوفر حاليا للحفاظ على التخدير الأيزوفلورين، التي يمكن تكييفها لتقديم رذاذ، بدلا من السائل القائم، التحدي الممرض أجهزة التهوية الميكانيكية.
وقد وضعت IMIT في البداية كمدخل لتحسين وصول البكتيريا إلى الرئة، ولكن لديه أيضا تطبيق لتسليم الكواشف الأخرى في الرئة الماوس. كما ديسالعناد أعلاه، تسليم داخل الأنف من المركبات في الفئران النتائج في انخفاض الكفاءة، والتسليم متغير بدرجة كبيرة من الكواشف إلى الجهاز المستهدف في الرئة. تسليم داخل الأنف من البوزيترون البوزيتروني (PET) الكواشف التصوير مع رئة الفئران أسفرت عن كفاءة تسليم 40٪ 11، في حين أننا أثبتنا أن IMIT يوفر بديلا ممتازا لغيرها من التسليم الرئة مع اقتراب لها> 98٪ كفاءة التسليم والتوزيع متعدد الفصوص. هذا التحسن في استهداف تسليمها إلى الرئة لديه القدرة على زيادة استنساخ تسليم العلاجي لعلاج مرض الرئة. IMIT يمكن أن توفر مزايا مماثلة للدراسات: ط) تأثير المهيجات البيئية الرئوية، والثاني) سرطان الرئة الدراسات المظهرية والثالث) سيرنا الرئة محددة تدق إلى أسفل.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful for the support from the Center for Predicative Medicine Animal Models (Carol Vanover, Ashley Biller and Jennifer Kraenzle) and Microbiology (Daniel Cramer and Julie Sotsky) Core Facilities. This work was supported by funding from the NIH (HHSN272201000033I to M.B.L and J.M.W.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC | 000A3467 | Base should be detached when working in a BSC |
| Operating Otoscope Head | Welch Allyn | 21700 | |
| Otoscope 3.5 V Li Battery | Welch Allyn | 71900 | |
| Mouse Intubation Specula short, Autoclaveable | Hallowell EMC | 200A3589S | |
| Incisor Loops | Hallowell EMC | 210A3490A | |
| Cotton fine tip applicator | Puritan | 871-PC DBL | Used for tongue retraction |
| I.V. Catheter, 20G | Exel Int | 26741 | Optional: fit a silicon sleeve with 10mm exposed catheter surface |
| Gas tight syringe, 250ul | Hamilton | 81120 | Used for delivery of liquid inoculum by IMIT |
| Blunt Needle, 22G | Hamilton | 91022 | Trim to length to protrude 1mm from 20G catheter |
| Guide wire (Fiber optic wire, 0.5mm) | TheFiberOpticStore.com | FOF .50 | Cut to 6" length: used as guide wire for intubation |
| Tuberculin syringe, 1ml | Becton Dickinson | 309659 | Assemble with fiber optic wire as guide wire |
| Brilliant Blue R (Coomassie) | Sigma | B0149 | |
| Tygon tubing, 1/16" | Saint Gobain | ALC00002 | |
| Male luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45503-22 | |
| Female luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45500-00 | |
| Lidocaine, USP | Spectrum | LI102 | pH lidocaine into solution at 2%(w/v) pH7.0 |
| Sample bag, 1oz | Whirl-Pak | B01067 | |
| U-bottom 96 well plate, sterile | Greiner | 650161 |
References
- Reznik, G. K. Comparative anatomy, physiology, and function of the upper respiratory tract. Environ Health Perspect. 85, 171-176 (1990).
- Hoyt, R. F. J., Hawkins, J. V., St. Clair, M. B., Kennet, M. B., Fox, J. G., et al. Chapter 2. The Mouse in Biomedical Research, Volume 2, Second Edition: Diseases (American College of Laboratory Animal Medicine). 2, 23-90 (2007).
- Visweswaraiah, A., Novotny, L. A., Hjemdahl-Monsen, E. J., Bakaletz, L. O., Thanavala, Y. Tracking the tissue distribution of marker dye following intranasal delivery in mice and chinchillas: a multifactorial analysis of parameters affecting nasal retention. Vaccine. 20, 3209-3220 (2002).
- Eyles, J. E., Spiers, I. D., Williamson, E. D., Alpar, H. O. Tissue distribution of radioactivity following intranasal administration of radioactive microspheres. J Pharm Pharmacol. 53, 601-607 (2001).
- Southam, D. S., Dolovich, M., O’Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 282, 833-839 (2002).
- Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS ONE. 7, (2012).
- Lathem, W. W., Crosby, S. D., Miller, V. L., Goldman, W. E. Progression of primary pneumonic plague: a mouse model of infection, pathology, and bacterial transcriptional activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17786-17791 (2005).
- Warawa, J. M., Long, D., Rosenke, R., Gardner, D., Gherardini, F. C. Bioluminescent diagnostic imaging to characterize altered respiratory tract colonization by the Burkholderia pseudomallei capsule mutant. Front Microbiol. 2, 133 (2011).
- Gutierrez, M., Pfeffer, T. L., Warawa, J. M. Type 3 Secretion System cluster 3 is a critical virulence determinant for lung-specific melioidosis. Submitted. , (2014).
- Fodah, R. A., et al. Correlation of Klebsiella pneumoniae comparative genetic analyses with virulence profiles in a murine respiratory disease model. PLoS ONE. In revision, (2014).
- Soto-Montenegro, M. L., et al. Assessment of airway distribution of transnasal solutions in mice by PET/CT imaging. Mol Imaging Biol. 11, 263-268 (2009).
