تقنية المشتريات الكبد الخنازير وزرع مثلي باستخدام أحدث بورتو الأجوف التحويلة
Summary
Experimental animal research plays a pivotal role in the development of clinical transplantation practice. The porcine orthotopic liver transplantation model (OLTx) closely resembles human conditions and is frequently used in clinically oriented research. The following protocol contains all information for a reliable porcine OLTx model using an active porto-caval-jugular shunt.
Abstract
The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. Each year, a considerable number of patients on the liver transplantation waiting list die without receiving an organ transplant or are delisted due to disease progression. Even after a successful transplantation, rejection and side effects of immunosuppression remain major concerns for graft survival and patient morbidity.
Experimental animal research has been essential to the success of liver transplantation and still plays a pivotal role in the development of clinical transplantation practice. In particular, the porcine orthotopic liver transplantation model (OLTx) is optimal for clinically oriented research for its close resemblance to human size, anatomy, and physiology.
Decompression of intestinal congestion during the anhepatic phase of porcine OLTx is important to guarantee reliable animal survival. The use of an active porto-caval-jugular shunt achieves excellent intestinal decompression. The system can be used for short-term as well as long-term survival experiments. The following protocol contains all technical information for a stable and reproducible liver transplantation model in pigs including post-operative animal care.
Introduction
زراعة الكبد مثلي (OLTx) هو الخيار الوحيد لعلاج المرضى الذين يعانون من أمراض الكبد في نهاية المرحلة أو سرطان الكبد المتقدم. على مدى السنوات ال 25 الماضية، ازداد عدد المرشحين على قائمة الانتظار تدريجيا، والآن يفوق بكثير عدد الطعوم المتاحة. في معظم مناطق زراعة، 20-30٪ من المرضى على قائمة الانتظار لزرع الكبد يموتون دون تلقي زرع الأعضاء أو شطب بسبب تطور المرض. استراتيجيات لزيادة تجمع المانحين، وبالتالي، فإن عدد الطعوم المتاحة، يطلب من أمس. لا تزال المعايير بمد تخصيص الجهاز، والحفاظ على الكسب غير المشروع لفترات طويلة، وتحريض التحمل المناعي تمثل تحديات السريرية الرئيسية 1-3. وبالتالي، والبحوث OLTx التجريبي محوريا من أجل تحسين الممارسة السريرية OLTx.
الخنازير OLTx هو نموذج تجريبي راسخة يشبه OLTx الإنسان بطرق كثيرة منها لحجم إيفر، وعلم التشريح، علم وظائف الأعضاء و4-6. وهكذا، فقد أصبح المنهج التجريبي القياسية في المجالات البحثية مثل التقنيات الجراحية، علم وظائف الأعضاء، علم المناعة، والحفاظ على وإصابة نقص التروية ضخه. وقد وصفت العديد من التقنيات المشتريات الكسب غير المشروع، استئصال الكبد المتلقي، وعلى وجه الخصوص، وإعادة بناء الأوعية الدموية، في الأدب 5. اختيار التقنية المناسبة يختلف وفقا لتفضيل الباحث والقدرة التقنية.
وعلى النقيض من السيناريو البشري، واحتقان حشوي خلال المرحلة anhepatic يمثل مشكلة هامة في الخنازير OLTx. نقص تروية الأمعاء لاحق وتلف الأوعية الدموية يمكن أن يسبب عدم الاستقرار الاحتقاني الدورة الدموية الشديدة، مما يهدد بقاء خنزير، وبالتالي، فإن نجاح التجربة 7-9. وبالتالي، الضغط الأمعاء كافية إلزامي، خصوصا في إعدادات التجريبية المكرر أقل من الناحية الفنية.
لناجي نشط تحويلة بورتو الأجوف-حبل الوريد لمدة المرحلة anhepatic هو خيار يمكن الاعتماد عليها لتجنب الازدحام الأمعاء. ويمكن استخدام هذا النظام لإجراء التجارب ضخه في وقت مبكر، فضلا عن سيناريوهات البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل. بروتوكول التالية يحتوي على كافة المعلومات عن نموذج الكبد زرع مستقرة وقابلة للتكرار في الخنازير، بما في ذلك المشتريات الكبد المانحة، بما في ذلك عملية المتلقي استئصال الكبد وتقنيات إعادة بناء سفينة نهاية إلى نهاية، والرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية.
Protocol
Representative Results
Discussion
التجريبية الخنازير OLTx هو إجراء صعبة لإعداد البحوث دون موارد الرعاية المركزة لسيناريو السريري. وتشمل المضاعفات المحتملة عدم الاستقرار الدورة الدموية، ونزيف، نقص تروية الأعضاء، انخفاض حرارة الجسم، والتمثيل الغذائي، وكذلك الجهاز التنفسي والمعاوضة. لأي مجموعة الأبحاث والتدريب الإجرائي كافية من تقنية جراحية 5 وكذلك 14،15 التخدير خنزير إلزامي من أجل تحقيق نتائج تمثيلية وقابلة للتكرار.
وقد وصفت العديد من الخفايا الفنية في الأدب، وخاصة فيما يتعلق مرحلة إعادة الإعمار الأوعية الدموية 5. بروتوكول OLTx المذكورة أعلاه يوفر المعلومات المطلوبة للحصول على نموذج استبدال الأجوف تشبه OLTx الإنسان. النتائج المقدمة تثبت بقاء الحيوان موثوق بها والانتعاش الكسب غير المشروع في كل من HBD وDCD النماذج. بروتوكول ينطبق في سيناريوهات البقاء على قيد الحياة على المدى القصير المستخدمة في الكسب غير المشروع ضخه بةriments، على سبيل المثال، وكذلك في نماذج البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل مثل دراسات التسامح.
واحد عقبة كبيرة من الخنازير OLTx هو التسامح فقيرة نسبيا من الأجوف والوريد البابي عبر لقط. الازدحام حشوي خلال المرحلة anhepatic يسبب ارتفاع ضغط الدم الوريدي وأذية الأوعية الدموية يمكن أن يؤدي إلى نقص تروية الأمعاء كبير وعدم الاستقرار الدورة الدموية إلى وجهة صدمة لا رجعة فيه حتى بعد الجهاز ضخه 7. منذ الوريد الأجوف هو جزء لا يتجزأ تماما في حمة الكبد، وهو إجراء أصبع ظهر الحفاظ الأجوف ليس ممكنا. الانسداد الكلي للالوريد الأجوف خلال مرحلة إعادة الإعمار الأجوف يضعف استقرار الدورة الدموية من الخنزير. على الرغم من أن تظهر بعض التقارير أن الخنازير OLTx يمكن إنجازه خلال مجموع الأجوف والوريد البابي انسداد أقل من 25 دقيقة 16،17، وهي تقنية تجاوز بورتو الأجوف-الوداجي في هذا الوقت من إعادة بناء الأوعية الدموية هي خيار أكثر أمانا وأكثر عملية 7- 9،18. في التجربة الكتاب الإلكتروني "، وهي السلبي بورتو الوداجي الالتفافية ليس الأمثل للحفاظ على الدورة الدموية الخنازير مستقرة خلال المرحلة anhepatic. نموذج الالتفافية، بما في ذلك الضغط الفعال على حد سواء الأجوف infrahepatic والوريد البابي، ويسمح في مرحلة إعادة الإعمار هادئة من anastomoses الأجوف والمداخل فوق الكبد حتى مع طول المدة لقط بسبب مضاعفات غير متوقعة. وخلافا لتقارير سابقة 7، وهو استئصال الطحال ليس إلزاميا عند إزالة القسطرة البوابة الالتفافية. كل من الشريان والوريد الطحال مغلقة في منتصف المسافة تقريبا على طول طول الطحال وترك النصف الداني perfused لبالقدر الكافي. المضاعفات مثل النزيف أو انسداد الهواء بسبب تجاوز انقطاع يمكن تجنبها عن طريق ضمان أن يتم وضع الالتفافية بعناية وتأمينها بشكل صحيح.
في البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل OLTx التجارب، ويعتبر مفاغرة القناة الصفراوية نقطة ضعف بسبب ارتفاع نسبة المضاعفات في 19. الأنسجة الصفراوية هي هشة للغاية وشمال شرقرعاية خاصة محرران عندما يجري التعامل معها. وقد وصفت العديد من التقنيات المختلفة مفاغرة 5،19. ومفاغرة نهاية إلى نهاية سهلة من الناحية الفنية والمرتبطة مع الحد الأدنى من مضاعفات 19. A خياطة مستمرة مع إبرة عدم القطع، بما في ذلك قطاعات كبيرة من النسيج الضام peribiliary يبدو أن تتفوق على لخياطة توقف. يتم وضع القناة الصفراوية تحت توتر غير ضروري عندما يتم معقود غرز واحدة من خياطة توقف. وهذا قد يؤدي في البكاء الأنسجة وتسرب الصفراء متتالية. المواد خياطة – امتصاص أو غير قابل للامتصاص – هي عادة ليست مهمة، نظرا لبقائه محدود حتى يتم إنهاء الخنزير. لنماذج البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل على مدى عدة أشهر، الغرز للامتصاص – كما هو الحال في OLTx الإنسان – هي الأفضل.
يجب توخي الحذر محددة مع ما بعد الجراحة المتابعة. التغذية الكافية وإمدادات السوائل، وبروتوكول تخفيف الآلام موثوق بها، وكبت المناعة السليمنظام إلزامية. لإجراء التجارب على المدى الطويل، يظهر المناعة أهمية خاصة. بالمقارنة مع الثدييات الأخرى، تظهر الخنازير لانخفاض مفاجئ نسبة الرفض المناعي بعد OLTx 20،21. تسلل خلية المستديرة القصوى خلال الأسبوع الثاني بعد الزرع وتقلل من تلقاء أنفسهم حتى من دون كبت المناعة. رفض نادرا ما يكون سبب الوفاة بعد الخنازير OLTx 22. ولكن، حتى مع بروتوكول المناعة تنطوي إدارة المنشطات الرابع ومثبطات الكالسينيورين بو المذكورة هنا، يشار إلى رفض الكسب غير المشروع عن طريق زيادة معتدلة من الترانساميناسات ابتداء من الساعة حوالي 4 أيام بعد OLTx وأكدته واضح الحقل بوابة تسلل خلية وإيابا. يمكن إعطاء مثبطات الكالسينيورين إما ص 23،24 أو 25،26 د. كلتا الطريقتين لها عيوب. حتى مع المساعدات التطبيق عن طريق الفم، والمبلغ الفعلي الوصول إلى القناة الهضمية لا يزال بعيد المنال. من ناحية أخرى، ضخ الرابع المستمر فيالقلم خنزير مع حيوان نشط أمر صعب. وبالتالي، يجب إجراء تطبيق الرابع باعتباره البلعة، مما يؤدي إلى قمم تركيز الدواء عالية جنبا إلى جنب مع الآثار السامة المحتملة. ومع ذلك، يبدو أن كلا طرق التطبيق للسماح للبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل.
على غرار عملية إعداد سريرية، فمن المستحسن بعد العمليات الجراحية قرحة الضغط الوقاية. النزيف بعد العمليات الجراحية من القرحة الهضمية هي مشكلة متكررة ويمكن أن تكون ذات صلة إلى وظائف الكبد ضعاف 27. بعد عدد قليل من حالات نزيف الجهاز الهضمي في كلا المجموعتين OLTx، بدأت المؤلفين الوقاية منتظمة مع بانتوبرازول ولم تشهد أي نزيف الجهاز الهضمي منذ ذلك الحين.
صيانة صارمة من ظروف معقمة اثناء العمليات القيصرية، مقارنة مع الظروف في غرفة العمليات السريرية، والعلاج الوقائي للمضادات الحيوية يترتب على ذلك، ويقلل من خطر حدوث مضاعفات معدية.
في الختام، هذه المادة صrovides المعلومات العملية لوضع برنامج OLTx الخنازير في إعداد البحوث. التفاني كافية، والممارسة، والعمل الجماعي مهم من أجل تقليل فترة التعلم، وتحقيق نتائج يمكن الاعتماد عليها، والحد من التكاليف وعدد من حيوانات التجارب.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The study was supported by research grants from the Roche Organ Transplant Research Foundation (ROTRF) and Astellas. Markus Selzner was supported by an ASTS Career Development Award. Matthias Knaak was supported by the Astellas Research Scholarship. We thank Uwe Mummenhoff and the Birmingham family for their generous support.
Materials
| Atropine Sulphate 15mg/30mL | Rafter 8 Products | 238481 | |
| Buprenorphine 0.3mg/mL | RB Pharmaceuticals LDT | N/A | |
| Cefazolin 1g | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2237138 | |
| Cyclosporin Oral Solution 5000mg/50mL | Novartis Pharmaceuticals Canada Inc. | 2150697 | |
| Fentanyl Citrate 0.25mg/5mL | Sandoz Canada Inc. | 2240434 | |
| Heparin 10,000iU/10mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Isoflurane 99.9%, 250mL | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000mg/50mL | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
| Lactated Ringer’s + 5% Dextrose, 0.5L | Baxter Corporation | 61131 | |
| Lacteted Ringer’s, 1L | Baxter Corporation | 61085 | |
| Metronidazole 500mg/100mL | Baxter Corporation | 870420 | |
| Midazolame 50mg/10mL | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
| Pantoprazole 40mg | Sandoz Canada Inc. | 2306727 | |
| Potassium Chloride 40mEq/20mL | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Propofol 1000mg/100mL | Pharmascience Inc. | 2244379 | |
| Protamine Sulfate 50mg/5mL | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2139537 | |
| Saline 0.9%, 1L | Baxter Corporation | 60208 | |
| Sodium Bicarbonate 50 mEq/50mL | Hospira Healthcare Corporation | 261998 | |
| Solu-Medrol 500mg | Pfizer Canada Inc. | 2367963 | |
| Tranexamic Acid 1000mg/10mL | Pfizer Canada Inc. | 2064413 | |
| University of Wisconsin Solution, SPS-1 | Organ Recovery Systms | SPS-1 | |
| Xylocaine Endotracheal 10mg/50mL | AstraZeneca | 2003767 | |
| Appose ULC 35W skin stapler | Covidien Canada | 803712 | |
| Maxon, 1 | Covidien Canada | 606173 | |
| Sofsilk, 0 | Covidien Canada | S606 | |
| Sofsilk, 2-0 | Covidien Canada | S405 | |
| Sofsilk, 3-0 | Covidien Canada | S404 | |
| Surgipro II, 4-0 | Covidien Canada | VP581X | |
| Surgipro II, 5-0 | Covidien Canada | VP725X | |
| Surgipro II, 6-0 | Covidien Canada | VP733X | |
| Catheter i.v, 18 G | BD Canada | 381147 | |
| Cook TPN catheter, 9.5Fr | Cook Medical Company | C-TPNS-9.5-90 | |
| PSI Kit for sheath catheter, 8.5Fr | Arrow International | ASK-09803-UHN | |
| Infusion Pump Line | Smith Medical ASD Inc. | 21-0442-25 | |
| Liver Admin Set (flush line) | CardioMed Supplies Inc | 17175 | |
| Mallinckrodt, Tracheal Tube, 6.5mm | Covidien Canada | 86449 | |
| Med-Rx Suction Connecting Tube | Benlan Inc. | 70-8120 | |
| Organ Bag | CardioMed Supplies Inc | 2990 | |
| Suction Tip | Tyco Healthcare Group LP | 8888501023 | |
| Valleylab, Cautery Pencil | Covidien Canada | E2515H | |
| Valleylab, Patient Return Electrode | Covidien Canada | E7507 | |
| Bypass Connector 3/8” x 1/4“ | Raumedic AG | 955083-001 | |
| Bypass Connector 3/8” x 3/8” Luer Lock | Raumedic AG | 955163-001 | |
| Bypass Connector Y 3/8” x 3/8” x 1/4” | Raumedic AG | 961360-002 | |
| Bypass Tubing 1/4” x 1/16” | Raumedic AG | 039505-010 | |
| Bypass Tubing 3/8” x 3/32” | Raumedic AG | 039535-005 | |
| Rotaflow Cenrtifugal Pump | Maquet-Dynamed | HC 2821 | |
| Stainless Steel Hose Clamp Ring, 5mm | Oetiker | 16700007 | |
| Abdominal Retractor | Medite GmbH | N/A | |
| De Bakey – Beck, Infrahepatic Cava Clamp | Aesculap Inc. | FB519R | |
| Diethrich, Atraumaitc Clamp (Portal Vein) | Aesculap Inc. | FB525R | |
| Gregory Bull Dog Clamp, curved | Aesculap Inc. | FB382R | |
| Gregory Bull Dog Clamp, straight | Aesculap Inc. | FB381R | |
| Potts – De Martel, Scissors | Aesculap Inc. | BC648R | |
| Satinsky, Suprahepatic Cava Clamp | Aesculap Inc. | FB605R | |
| Symetrical Tubing Clamp | Codman Instruments | 198010 | |
| Anesthesia Machine, Optimax | Moduflex Anesthesia Equipment | SN5180 | |
| Bypass Flow meter, HT 110 | Transonic Systems Inc. | HT110B11106 | |
| Flow meter probe, H6XL | Transonic Systems Inc. | H6Xl689 | |
| Heat Therapy Pump, T/Pump | Gaymar Industries Inc | TP500-G89D19 | |
| Infusion Pump 3000 | SIMS Graseby LTD. | SN300050447 | |
| Isoflurane Vapor 19.1 | Draeger Medical Canada Inc. | N/A | |
| Monitor, Datex AS 3 | Instrumentarium Corp./ Hitachi | D-VHC14-23-02 | |
| Rotaflow Centrifugal Drive Unit | Marquet-Dynamed | 952301 | |
| Rotaflow Console | Marquet-Dynamed | 706035 | |
| Temperature Therapy Pad | Gaymar Industries Inc | TP26E | |
| Valleylab Force Tx | Valleylab Inc. | 216151480 | |
| Ventilator, AV 800 | DRE Medical Equipment | 40800AVV | |
| Warm Touch, Patient Warming System | Nellcor/ Covidien Canada | 5015300A |
References
- Mehrabi, A., Fonouni, H., Muller, S. A., Schmidt, J. Current concepts in transplant surgery: liver transplantation today. Langenbecks Arch. Surg. 393 (3), 245-260 (2008).
- Qiu, J., Ozawa, M., Terasaki, P. I. Liver transplantation in the United States. Clin. Transpl. , 17-28 (2005).
- Chalstrey, L. J. Technique of orthotopic liver transplantation in the pig. Br. J. Surg. 58 (3), 585-588 (1971).
- Esmaeilzadeh, M. Technical guidelines for porcine liver allo-transplantation: a review of literature. Ann. Transplant. 17 (2), 101-110 (2012).
- Calne, R. Y. Observations of orthotopic liver transplantation in the pig. Br. Med. J. 2 (5550), 478-480 (1967).
- Memsic, L., Quinones-Baldrich, W., Kaufman, R., Rasool, I., Busuttil, R. W. A comparison of porcine orthotopic liver transplantation using a venous-venous bypass with and without a nonpulsatile perfusion pump. J. Surg. Res. 41, 33-40 (1986).
- Torres, O. J. Hemodynamic alterations during orthotopic liver experimental transplantation in pigs. Acta. Cir. Bras. 23 (2), 135-139 (2008).
- Battersby, C., Hickman, R., Saunders, S. J., Terblanche, J. Liver function in the pig. 1. The effects of 30 minutes’ normothermic ischaemia. Br. J. Surg. 61 (1), 27-32 (1974).
- Smith, A. C., Swindle, M. M. Preparation of swine for the laboratory. Ilar. J. 47 (4), 358-363 (2006).
- Swindle, M. M., Smith, A. C. Best practices for performing experimental surgery in swine. J. Invest. Surg. 26 (2), 63-71 (2013).
- Moench, C., Moench, K., Lohse, A. W., Thies, J., Otto, G. Prevention of ischemic-type biliary lesions by arterial back-table pressure perfusion. Liver Transpl. 9 (3), 285-289 (2003).
- Koski, E. M., Suhonen, M., Mattila, M. A. Ultrasound-facilitated central venous cannulation. Crit. Care Med. 20 (3), 424-426 (1992).
- Lange, J. J., Hoitsma, H. F., Meijer, S. Anaesthetic management in experimental orthotopic liver transplantation in the pig. Eur. Surg. Res. 16 (6), 360-365 (1984).
- Kaiser, G. M., Heuer, M. M., Fruhauf, N. R., Kuhne, C. A., Broelsch, C. E. General handling and anesthesia for experimental surgery in pigs. J. Surg. Res. 130 (1), 73-79 (2006).
- Heuer, M. Liver transplantation in swine without venovenous bypass. Eur. Surg. Res. 45 (1), 20-25 (2010).
- Gruttadauria, S. Porcine orthotopic liver autotransplantation: facilitated technique. J. Invest. Surg. 14 (2), 79-82 (2001).
- Falcini, F. Veno-venous bypass in experimental liver transplantation: portal-jugular versus caval-portal-jugular. G. Chir. 11 (4), 206-210 (1990).
- Filipponi, F., Benassai, C., Falcini, F., Martini, E., Cataliotti, L. Biliary tract complications in orthotopic liver transplantation: an experimental study in the pig. Ital. J. Surg. Sci. 19 (2), 131-136 (1989).
- Terblanche, J. Orthotopic liver homotransplantation: an experimental study in the unmodified pig. S. Afr. Med. J. 42 (20), 486-497 (1968).
- Calne, R. Y. Prolonged survival of liver transplants in the pig. Br. Med. J. 4 (5580), 645-648 (1967).
- Battersby, C., Egerton, W. S., Balderson, G., Kerr, J. F., Burnett, W. Another look at rejection in pig liver homografts. Surgery. 76 (4), 617-623 (1974).
- Net, M. The effect of normothermic recirculation is mediated by ischemic preconditioning in NHBD liver transplantation. Am. J. Transplant. 5 (10), 2385-2392 (2005).
- Guarrera, J. V. Hypothermic machine perfusion of liver grafts for transplantation: technical development in human discard and miniature swine models. Transplant Proc. 37 (1), 323-325 (2005).
- Minor, T. Hypothermic reconditioning by gaseous oxygen improves survival after liver transplantation in the pig. Am. J. Transplant. 11 (12), 2627-2634 (2011).
- Kelly, D. M. Porcine partial liver transplantation: a novel model of the ‘small-for-size’ liver graft. Liver Transpl. 10 (2), 253-263 (2004).
- Meijer, S., Hoitsma, H. F., Visser, J. J., de Lange, J. J. Long term survival following orthotopic liver transplantation in pigs; with special reference to gastric ulcer complications. Neth. J. Surg. 36 (6), 168-171 (1984).
