JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Методика свиной печени закупок и Ортотопическая трансплантации с использованием активного Порто-Caval шунт

Published: May 07, 2015
doi:
10.3791/52055
, , , , ,
1Multi Organ Transplant Program, Department of Surgery,Toronto General Hospital

Summary

Experimental animal research plays a pivotal role in the development of clinical transplantation practice. The porcine orthotopic liver transplantation model (OLTx) closely resembles human conditions and is frequently used in clinically oriented research. The following protocol contains all information for a reliable porcine OLTx model using an active porto-caval-jugular shunt.

Abstract

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. Each year, a considerable number of patients on the liver transplantation waiting list die without receiving an organ transplant or are delisted due to disease progression. Even after a successful transplantation, rejection and side effects of immunosuppression remain major concerns for graft survival and patient morbidity.

Experimental animal research has been essential to the success of liver transplantation and still plays a pivotal role in the development of clinical transplantation practice. In particular, the porcine orthotopic liver transplantation model (OLTx) is optimal for clinically oriented research for its close resemblance to human size, anatomy, and physiology.

Decompression of intestinal congestion during the anhepatic phase of porcine OLTx is important to guarantee reliable animal survival. The use of an active porto-caval-jugular shunt achieves excellent intestinal decompression. The system can be used for short-term as well as long-term survival experiments. The following protocol contains all technical information for a stable and reproducible liver transplantation model in pigs including post-operative animal care.

Introduction

Трансплантация печени Ортотопическая (OLTx) является единственным вариантом лечения для пациентов с терминальной стадией заболевания печени или гепатоцеллюлярной карциномы передовых. За последние 25 лет, количество кандидатов в списке ожидания постепенно увеличивается и в настоящее время намного превышает количество доступных трансплантатов. В большинстве регионов трансплантации, от 20 до 30% пациентов, включенных в список очередников для трансплантации печени умирают, не получая трансплантации или исключены из-за прогрессирования заболевания. Стратегии повышения доноров бассейн и, таким образом, количество доступных трансплантатов, отчаянно требуется. Развернутый критерии распределения орган, длительное сохранение трансплантата, и индукции иммунологической толерантности по-прежнему представляют собой основные клинические проблемы 1-3. Следовательно, экспериментальное исследование OLTx имеет решающее значение для того, чтобы оптимизировать клиническую практику OLTx.

Свиноводство является OLTx хорошо создана экспериментальная модель, которая напоминает человеческую OLTx во многих отношениях, включая лРазмер Iver, анатомия, и физиология 4-6. Таким образом, он стал стандартом экспериментальный метод в научных областях, таких как хирургические методы, физиологии, иммунологии, сохранение и ишемии-реперфузии. Многочисленные методы трансплантата закупок, получатель резекции печени, и, в частности сосудистой реконструкции, были описаны в литературе 5. Выбор подходящего метода варьируется в зависимости от предпочтений исследователя и технических возможностей.

В отличие от человека сценарии внутренностный заторов в течение anhepatic фазы представляет важную проблему в свиной OLTx. После кишечная ишемия и застойной сосудистой ущерб может привести к серьезным нестабильности гемодинамики, ставя под угрозу выживание свиньи и, таким образом, успех эксперимента 7-9. Таким образом, достаточно кишечного декомпрессии является обязательным, особенно в менее технически изысканных экспериментальных условиях.

НамIng активную порто-вены-шунт яремную для продолжительности anhepatic фазы является надежным вариантом, чтобы избежать перегруженности кишечника. Система может быть использована для ранних экспериментов реперфузионных а также сценариев долгосрочного выживания. Следующий протокол содержит всю информацию для стабильного и воспроизводимого печени трансплантации модели у свиней, в том числе доноров закупок печени, в том числе работы получателя резекции печени и конца в конец методов реконструкции судно, и послеоперационного ухода.

Protocol

Все животные получали гуманного ухода в соответствии с '' Принципы лабораторных животных '', сформулированных Национальным обществом для медицинских исследований и '' Руководство по уходу за лабораторными животными '' опубликован Национальными Институтами Здоровья, Онтарио, Канада , Уход Комитет животных в Торонто Генеральной научно-исследовательского института одобрил все исследования. 1. Орган поисковая Дом мужчины Йоркшир свиней от 30 до 35 кг в научно-исследовательский центр в течение 1 недели до трансплантации, чтобы предотвратить стресс-индуцированной физической реакции (которая может изменить исход перфузии в 10,11) и акклиматизироваться животных, чтобы жилищных условий. Быстрое свинью в течение как минимум 6 часов до индукции анестезии. Обезболить доноров свинью внутримышечной (IM) инъекции смеси кетамина (25 мг / кг), атропин (0,04 мг / кг) и мидазолама (0,15 мг / кг). </li> До интубации, обеспечить свинья спонтанно дышит 2 л кислорода дозированное с 5% изофлуран. В положении лежа на спине, спрей голосовые связки с 2% лидокаин 2 мин перед интубации, чтобы избежать вокальные спазмы мозга. Для 35 кг свиньи, использовать 6,5 Fr трахеи трубки. Блок трахеи трубку с 3 – 5 мл воздуха в помещении. После интубации, используйте capnometry, чтобы подтвердить правильность интубации. Монитор сердечного ритма и насыщения кислородом по пульсоксиметрии в хвост свиньи. Опустите ИФ испаритель до 2%. Регулировка глубины анестезии минимальным альвеолярной концентрации (ПДК) значения; стремиться к 2 – 2,5 ПДК. Установите вентилятор 14 – 16 вдохов / мин и приливно-отливной объема 10 – 15 мл / кг массы тела. Разместить 18 г внутривенно (IV) катетер в одном из вен уха, чтобы вливание лактата Рингера (200 мл / ч). Скраб свинью и покрыть ее стерильными пеленками. Убедившись, стерильные условия, сделать срединной лапаротомии FOLLOво главе с левым боковым расширением. Используйте полотенце, чтобы покрыть большие и малые кишечника перед их перемещением с левой стороны. Разделите серповидной связки и треугольное связки, используя прижигания. Отпустите печень от диафрагмы на правой стороне, используя электро-прижигание; использовать ножницы для верхней части между веной и диафрагмы. Рассеките infrahepatic вены до филиала надпочечников вены на правой стороне и почечной вены на левой стороне. Отделите infrahepatic вены и аорты дистального друг от друга; перевязывать ветви аорты к позвоночнику; изолировать и бесплатных почечных артерий из клейкого ткани. Окружите каждый почечной артерии с 2-0 галстук. Черепно в левой почечной вене, рассекают аорты и брыжеечной артерии. Окружите брыжеечной артерии с 2-0 галстук. После открытия брюшины краниально к брыжеечной артерии, внимательно следить за аорты к чревного ствола. Проанализируйте чревного ствола каудально на портале вев; окружают селезенки и левой желудочной артерии, которые разветвляются в задней от чревного ствола. Проанализируйте чревного ствола от воротной вены. Отпустите воротной вены с помощью перитонеального разрез между поджелудочной железы и портальной вены. Галстук вены, впадающие из поджелудочной железы в воротной вене. Отделите желчный проток из печеночно связки и разделить его дистально после перевязки. Перевязывать лимфатические сосуды внутри печеночно связки, чтобы предотвратить утечку лимфатическую. Разделите гастродуоденальной артерии и артерии желудка правильные между связями. Перевязывать мелкие вены. Проанализируйте аорты позади диафрагмы между сердцем и чревного ствола. Поместите 2-0 галстук вокруг аорты краниально к чревного ствола. Удалить желчный пузырь и прижечь любое кровотечение из ложа желчного пузыря. Откройте диафрагму. Администрирование 1000 МЕ / кг массы донорской гепарина внутрисердечно или внутривенно указан изофлурана до 5% (> 2,5 ПДК) для того, чтобы достичьглубже анестетик уровень. Для донора после смерти кровообращения (ДКД) модели, вызвать остановку сердца в внутрисердечной инъекции 40 mval KCl 3 мин после введения гепарина. Установите остановка сердца в качестве отправной точки теплой ишемии. Галстук ранее установленные связи по всему почек, мезентериальных, селезеночной и левой, артерий желудка. Галстук аорты дистальнее почечных между и подвздошных артерий и аорты иглу с органной флеш линии. Свяжите от воротной вены, как проксимально, насколько это возможно, и иглу его с другим органом флеш линии. После закрытия предварительно заданного галстук вокруг проксимального отдела аорты, промойте печень с 2 л холодной университета Висконсина раствор (UW) с помощью двойной перфузии с помощью аорты (мешок) и давления воротной вены (тяжести приводом). Акцизный печень, оставив все остальные сосуды долго. Оставить щедрый диафрагмы обод вокруг suprahepatic вены. Поместите печень в стерильный мешок органов на льду. Во назад стола подготовки, клусилителя в suprahepatic вены, используя зажим Сатински и промойте печень второй раз с 0,5 л раствора UW ретроградно через нижний нижней полой вены до отток воротной вены не ясно. Свяжите от всех артериальных ветвей аорты и чревного ствола. Выполните перфузии артериального давления обратно стол с оставшимся 0,5 л раствора UW 12. Промойте желчный проток, используя решение UW. Обрезать диафрагмы патч для приличного размера. Закройте все диафрагмального вены – обычно 3, 1 слева и справа, и 1 задняя – с помощью 4-0 мононити полипропиленовые стежков. Закройте мешок органов и хранить печень на льду. 2. Получатель ГЕПАТЭКТОМИИ Обезболить свинью получатель с помощью внутримышечной инъекции смеси кетамина (25 мг / кг), атропин (0,04 мг / кг) и мидазолама (0,15 мг / кг). Поместите кота в положении лежа на спине на операционном столе поверх нагревательного мата. Накройте свиной Wiго тепла циркулирующим одеяло. До интубации, обеспечить свинья спонтанно дышит 2 л кислорода дозированное с 5% изофлуран. Спрей голосовые связки с 2% лидокаин 2 мин перед интубации, чтобы избежать вокальные спазмы мозга. Для 35 кг свиньи, использовать 6,5 Fr трахеи трубки. Блок трахеи трубку с 3 – 5 мл воздуха в помещении. После интубации, используйте capnometry, чтобы подтвердить правильность интубации. Монитор сердечного ритма и насыщения кислородом по пульсоксиметрии в хвост свиньи. Место и закрепите датчик температуры в рыло свиньи. Опустите ИФ испаритель до 2% (стремиться к 2 – 2,5 ПДК). Установите вентилятор 14 – 16 вдохов / мин и приливно-отливной объема 10 – 15 мл / кг массы тела. Используйте мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Используйте технику Сельдингера 13 вставить оболочки индуктор (8,5 Fr) в левой наружной яремной вены. Используйте этот катетер позже для активного обхода портал-вены-яремной. Используйте Сельдингера techniquе, чтобы вставить общую парентерального питания (ТПС) катетер (9,5 Fr) в правой наружной яремной вены. В стерильных условиях, рассекают в правую сонную артерию и вставить катетер полипропилена (18 г) для мониторинга инвазивного артериального давления. Окружите артерии с 2-0 шелковый галстук, чтобы аварийный перевязка. Выключите изофлуран испаритель до 1% (1,5 – 2 ПДК) и добавить пропофол (5 – 8 мг / кг / ч внутривенно), чтобы сохранить глубину анестезии. Для обезболивания, использовать непрерывную внутривенную инфузию фентанилцитрата (наиболее предпочтителен, 2 мкг / кг / ч) или ремифентанил (второй вариант, 15 мкг / кг / ч). Перед разрезом кожи, дать 1000 мг цефуроксима и 500 мг метронидазола внутривенно. Настройка инфузионный насос, используя лактат Рингера с 5% глюкозы в 150 мл / ч. Поместите тепловой циркуляции одеяло на голову и область шеи. Скраб свинью и покрыть ее стерильными пеленками. В стерильных условиях, сделать срединной лапаротомии. Вставьте в животе гetractor, чтобы получить достаточный доступ к правом подреберье. Разделите falciforme связки и треугольное связки, используя прижигания. В нескольких шагах, разделить печеночно связки, близкий к печени между связями. Определить, разделить, и отметьте ветви артерии и желчного протока печени. Проанализируйте печеночной артерии ретроградным до разделения гастродуоденальной артерии. Убедитесь, что бульдог зажим подходит для вокруг общей печеночной артерии проксимальнее к гастродуоденальной артерии для последующего зажима. Освободите воротной вены из клейкого ткани. Мобилизация полую вену от забрюшинного пространства справа с использованием электро-прижигание. Используйте ножницы для верхней части между веной и диафрагмы. Рассеките infrahepatic вены до филиала надпочечников вены на правой стороне и почечной вены на левой стороне. Expose воротах селезенки. Примерно на полпути по длине селезенки, необходимо тщательно очистить оте селезеночной артерии и вены из прилипших брюшины слоев. Окружите как селезеночной артерии и вены с 4 2-0 шелковых галстуков. Вставьте 8,5 Fr оболочки индуктор с 2 дополнительными отверстиями в наконечнике катетера в селезеночной вены, указывая дистально к воротной вены. Закрепить катетер дистальнее его вставки с одной из 2-0 связей и закройте вены проксимальнее вставки с другим 2-0 галстука. Оставьте остальные 2 связи открытым. Забор крови из катетера, промыть ее с 10 мл физиологического раствора, и закройте фиксатор катетера. Заполните солевой раствор в байпас, состоящей из центробежного насоса, головки яремной трубки (3/16 "), и приток с обеих портальной ветви (3/16") и вены ветви (1/4 ", люэровского разъем на проксимальной открытие). Поместите зажим трубки на проксимальном конце полой трубки. Подключите портала и яремной открытие объездной в обоих оболочка для введения катетеров (рис 1) и запечатать Conneие с металлорукава зажимного кольца. Поместите центробежный насос голову в его положении насоса. Дайте 1000 мг транексамовой кислоты и 10 000 МЕ гепарина 3 мин IV до пережатия. Уменьшите скорость инфузии пропофола до 2 мг / кг / ч в течение времени anhepatic фазы. Отрегулируйте ИФ концентрации в артериального давления и реакционной свиньи. Откройте зажимы обеих оболочки для введения катетеров и кросс-зажима портальной вены. Убедитесь, что кровь проходит через байпас пассивно. Начните центробежный насос на около 1500 выстрелов / мин. Продолжить перекрестного зажима, если) свинья cardiovascularly стабильной и б) обхода работает около 500 мл / мин. Если свинья не терпит пережатие, заменить громкости (кристаллоидов или коллоидов) и инотропным агентов (норадреналина в малом комков). Крест зажим infrahepatic полую вену просто черепной в почечных вен с помощью зажима Де Бейки-Бек. Приложите усилие на TISS печениие выжать часть остатка крови. Кросс-зажим suprahepatic полую вену в том числе с использованием диафрагмы обода зажим Сатински а втягивания печени каудально. Вырезать suprahepatic полой вены непосредственно на ее границе с ткани печени. Затем разрезать на портальную вену возле печеночной воротах. Около 4 см краниально к infrahepatic вены зажима, вырезать отверстие в передней стенке полой вены. В это отверстие, поместите разъем открытия байпаса 'вены с люэровского перед вперед. Закрепите разъем в infrahepatic вены с 1-0 шелковых галстуков. Затем откройте зажим труб в вены филиала байпас. Наконец, откройте infrahepatic вены зажим, чтобы позволить вены-яремной байпас в дополнение к существующей порто-яремной байпас. Увеличение скорости насоса до примерно 2500 выстрелов / мин, так что отток байпаса на яремной стороне между 900 – 1100 мл / мин. Акцизный печень в оставшейся Connection краниально к разъему infrahepatic байпаса, гарантируя, что связи, обеспечивающие подключение байпаса не резать. Расположите обход трубки осторожно, чтобы избежать перегибов. Дайте 500 мг метилпреднизолона для инициализации иммунитета. 3. Реконструкция судно Использование 4-0 мононити полипропиленовые швов, закройте все 3 диафрагмального вены Остии на стороне получателя в отверстие в suprahepatic Cava в. Вышивание двойные вооружены 4-0 мононити полипропиленовые швов внутри-снаружи в обоих углах suprahepatic вены на стороне получателя. Удалить донорского органа мешок из коробки льда. Откройте сумку органов, удалить донорскую печень, и поместить его в брюшную полость. Для анастомоза конец в конец suprahepatic вены, отделка доноров suprahepatic полую вену, чтобы соответствовать стороне получателя. Использование внутри иглы стороне получателя угловых швов, сделать внутри-снаружи угловой шов на каждой из сторон в suprahepatic донор вены. Выстрел оба конца правой нити вместе. Приблизительная как Остии получателя и донора вены, затем связать обе концовки левой швом. Выстрел короткий конец и сделать снаружи внутри стежок вены реципиента задняя стенка рядом с галстуком. Запустите на задней стенке, в идеале выворачивания кава стены. Добавьте 2-3 передние стежки настенные с той же нити сразу правая сторона была достигнута, то снял это шовный концовку. Запустите на передней стенке, используя оставшиеся шов от левого угла. Свяжите оба швов, используемых для задней и передней стенок. Свяжите два других шовные окончания в правом углу. После обрезки донор воротной вены до соответствующей длины, выполнить воротной вены анастомоз конец-в-конец таким же образом, используя 6-0 мононити полипропиленовые швов. Незадолго до окончания с передней стенкой, интубация просвет вены infrahepatic с другим флеш линии и промойте решение UW 1 л физиологического растворапри комнатной температуре с помощью infrahepatic cavaportal вены. Заполните анастомоза и галстук швы, оставив примерно 0,5 см фактора роста. Иными Де Бек Bakey- зажим на доноров infrahepatic вены. Откройте suprahepatic вены зажим и проверить кровотечения. Затем, reperfuse печень, открыв портал зажим. Используйте 6-0 мононити полипропиленовые швов для гемостаза стежков. Уменьшить скорость обходного насоса до 1500 выстрелов / мин и закройте зажим портала оболочки для введения катетера. Reclamp сторону получателя infrahepatic полой вены и поставить хомут трубки на вены части объездной. Остановите центробежный насос. Вырезать связей с полой разъем и снимите его. Вернуться оставшуюся кровь через байпас к свинье через яремную катетер. Закройте зажим яремной катетер и отсоедините байпас. Получали 100 мг сульфата протамина антагонистами гепарина. Соблюдайте особую осторожность в пигемодинамика G во время этих шагов; использовать катехоламин для поддержания давления и замены бикарбоната натрия для метаболического ацидоза. Выполнение анастомоза конец в конец infrahepatic вены снова в порядке, описанном выше, с использованием 5-0 мононити полипропиленовые швов. Reperfuse в infrahepatic нижнюю вену, выпуская оба зажима. Обрезка аортальный патч вокруг чревного ствола донора. Галстук получателя гастродуоденальной артерии рядом с общей печеночной артерии. Положите бульдог зажим на общей печеночной артерии проксимальнее стыке гастродуоденальной артерии. Обрезать небольшой артериальное патч с ножницами Поттс, используя сосудистую ткань вокруг перехода. Промойте доноров печеночной артерии с 10 мл физиологического раствора гепарина и поставить еще бульдог зажим дальше дистально, чтобы избежать обратно кровотечение. Анастомозирует с артериальной Остии конец-в-конец в технике бега с парашютом, с использованием 6-0 Мононить полипропиленовая нить. Reperfuse первым ОПЕНин дистальной, а затем проксимальные бульдог зажимы. Анастомозирует с конца в конец желчного протока с 2 6-0 мононити полипропиленовые швов с использованием бегущего описанную выше методику. Убедитесь, что большие участки ткани peribiliary включены, потому что свиньи желчного протока очень хрупкие и легко рвется. После проверки гемостаза, удалить оболочку проводниковую катетер из селезеночной вены. Закройте первый и второй концы с остальными 2 связей. Закройте брюшной стенки с размером 1 мононити рассасывающиеся нити. Закройте кожу либо степлером кожи или любом 2-0 шва. 4. послеоперационном периоде Используйте грелку и тепловой циркуляции одеяло, чтобы держать свиней в тепле. Примеры газов крови ежечасно. Регулировка обезвоживание за счет увеличения скорости инфузии. Отучить анестезии. Проветривайте свинью еще на 2 часа. Снимите кожух проводниковую катетер из левой яремной вев. Нажмите твердо в течение нескольких минут, чтобы предотвратить кровотечение. Туннель ТПС катетер подкожно в сторону шеи свиньи. Закрепите его с 2-0 швов. Удалить артериальной линии после 2 часов, если свинья гемодинамически стабильным без поддержки катехоламинов. Убедитесь, что сторона прокол не кровоточит. В противном случае, сделать 6-0 кошелек-строку стежок вокруг артериальной отверстие, не закрывая артерии. Закройте разрез сайт. Остановите вентиляцию сразу свинья может самостоятельно дышать. Отключите трубку вентиляции от трахеи трубки. Повторно проверьте, если свинья достаточно дыхание. Поместите кота в положении лежа в одной ручкой животных, снабженной нагревательным лампы. Экстубации как только свиньи способны держать голову самостоятельно. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточно, чтобы поддерживать грудины лежачее положение. Дом свинья отдельно для всей послеоперационном периоде. Предоставлятьдостаточно IV обезболивающее после операции (например, бупренорфин 0.01 – 0.05 мг / кг каждые 6 часов). Если свинья не пить самостоятельно, заменить достаточно Том IV Продолжить метилпреднизолон как иммуносупрессии (250 мг послеоперационный день (POD) 1 утром и затем 125 мг каждое утро). Начните цефалоспориновым 2 мг / кг перорально два раза в день с POD2 на. Администрирование 500 мг метронидазола и 1000 мг два раза в день cefazoline, а также 20 мг пантопразола один раз в день до POD3. Монитор свинью тесно. Не стесняйтесь принести в жертву, если она показывает признаки страдания (например, апатия, реинфузия пить, постоянный ацидоз или гипогликемия, или признаки кровотечения или перитонита). Для эвтаназии, обескровить свинью под глубоким наркозом изофлуран (5%,> 2,5 ПДК) путем разрезания suprahepatic вены.

Representative Results

В первом исследовании трансплантации, сердечно-доноров бить модели (кч, N = 5), по сравнению с моделью DCD (N = 10) подвергается 45 мин теплой ишемии на месте. В обеих группах, трансплантаты были сохранены на льду в течение 10 часов после закупки. В группе кч, 100% свиней получателей не дожили до конца последующей деятельности по 5-й день после трансплантации. В группе DCD, только 50% свиней-реципиентов выживали в течение 5 дней из-за проблем коагуляции или метаболического декомпенсации, в результате снижения послеоперационной функции печени. Все образцы крови собирали из центрального венозного катетера. После центрифугирования, образцы сыворотки были получены и проанализированы для гепатоцеллюлярной травмы (аспартатаминотрансферазы, АСТ), желчных функции (общий билирубин и щелочной фосфатазы), и функции печени (INR). Конечно времени каждого маркера показано на рисунках 2 – 5. <p class="jove_content"> AST уровни достигли пика через 24 часов (1414 ± 538 Ед / л в группе кч и 2296 ± 1313 ед / л в группе DCD, р = 0,13) и возвращается к почти нормальным значениям через 5 дней. Аналогичным образом, щелочные фосфатазы значения были заметно возрастает после 36 часов в группе DCD (224 ± 111 Ед / л) по сравнению с группой кч (162 ± 54 МЕ / л, р = 0,27). В то время как общий билирубин был стабилен в группе кч (≤ 10 мкмоль / л) на протяжении, она постепенно увеличивалась в группе DCD до 5-й день (23 ± 31 мкмоль / л, р = 0,43). Большой стандартное отклонение значений билирубина в группе DCD показывает своеобразную неоднородности желчных травмы в этой группе. INR в качестве маркера функции печени показало тенденцию, подобную значений АСТ. Значения достиг 24 часов и были восстановлены почти нормальных значений через 5 дней. Группа ХАБАД, имели более низкие значения с максимумом при 1,47 ± 0,34 по сравнению с группой DCD (пик 1,70 ± 0,36, р = 0,32). <p class="jove_content" fo:keep-togetherНе познее-страницы = "всегда"> Рисунок 1. Схема порто-вены-яремной шунта. Байпас заполнено раствором лактата Рингера. Затем вены часть зажимается зажимом труб, яремной и селезенки части соединены с заданными катетеров, байпас открыт, и центробежный насос запускается после зажима портальной венозной. После резекции печени, вены часть объездной вставляется и крепится в infrahepatic полой вены пень, от головы к почечных вен. Зажим трубки освобождается, чтобы вены декомпрессии, в дополнение к портальной декомпрессии. Рисунок 2. аспартатаминотрансферазы (AST) (ХАБАД N = 5, DCD N = 10). АСТ является чувствительным маркером гепатоцеллюлярной травмы. Пик кормовойER 24 часа в кч ниже, чем в группе DCD, предполагая, менее реперфузионного повреждения печени; стандартное отклонение меньше, показывает более однородные результаты в группе кч. Рисунок 3. Общий билирубин (ХАБАД N = 5, DCD N = 10). Общий билирубин, в качестве маркера желчных оформления и желчных протоков целостности, показывает стабильный и однородный тенденцию со значениями ниже 10 мкмоль / л в группе кч. Кривая билирубина в группе постепенно увеличивается DCD с течением времени и показывает высокую стандартное отклонение, предполагая, желчных травмы лишь в части экспериментальной группе. Рисунок 4. щелочной фосфатазы (ХАБАД N = 5, DCD N = 10). Щелочную фосфатазу яS показатель желчных травмы. Значения группы кч ниже, чем в группе DCD, что предполагает меньшую желчных травмы. Рисунок 5. INR (ХАБАД N = 5, DCD N = 10). Высокое значение указывает уменьшенное INR гепатоцеллюлярной функцию за счет снижения высвобождения факторов свертывания. В обоих HBD и DCD групп, значения INR возврата к нормальным значениям через 5 дней после трансплантации, предполагая, восстановление функции печени. Значения для группы кч появляются ниже.

Discussion

Экспериментальная свиной OLTx является сложной процедурой для настройки исследования без ресурсов интенсивной терапии клинического сценария. Возможные осложнения включают нестабильность гемодинамики, кровотечения, органов ишемии, переохлаждения, и метаболическое, а также органов дыхания, декомпенсация. Для любого исследовательской группы, достаточных процедурных обучение хирургической техники 5, а также свиньи анестезии 14,15 является обязательным для достижения представительные и воспроизводимые результаты.

Многие технические тонкости были описаны в литературе, особенно в отношении фазы реконструкция сосудов 5. Протокол OLTx описано выше обеспечивает необходимую информацию для кава-замены модели, напоминающей человеческую OLTx. Предоставленные результаты демонстрируют надежное выживание животных и восстановление трансплантата в обеих моделях HBD и DCD. Протокол применяется в краткосрочных сценариев выживания, используемых в привитой реперфузии EXPEriments, например, а также в моделях долгосрочное выживание исследований, таких как толерантность.

Один большой препятствием свиного OLTx является относительно плохая переносимость вены и воротной вены пережатия. Чревных заторов во время фазы anhepatic вызывает венозной гипертензии и капиллярной ущерб, который может привести к крупной кишечной ишемии и гемодинамической нестабильности в точке необратимого шока даже после реперфузии органов 7. С полой вены полностью встроен в паренхимы печени, процедура контрейлерных кава-сохранение не представляется возможным. Общая окклюзия полой вены во время фазы реконструкции вены ухудшает гемодинамические стабильности свиньи. Хотя несколько отчеты показывают, что свиной OLTx может быть достигнуто в течение полного вены и воротной вены окклюзии менее чем на 25 мин 16,17, техника обхода порто-кава-яремной на время реконструкции сосудов является более безопасным и более практичным вариантом 7- 9,18. В гоОпыт E авторов, пассивный байпас порто-яремной не является оптимальным, чтобы свиньи гемодинамически стабильной в течение anhepatic фазы. Модель байпас, в том числе активного декомпрессии как infrahepatic вены и воротной вены, позволяет спокойно фазу реконструкции suprahepatic полых и портальных анастомозов даже с длительного времени зажима из-за непредвиденных осложнений. Вопреки более ранним сообщениям 7, спленэктомия не является обязательным, когда байпас портал катетер удаляется. Оба селезеночной артерии и вены закрыты примерно на полпути вдоль длины селезенки уходит из проксимального половину достаточно перфузии. Осложнения, как кровотечение или воздушной эмболии из-за отключения обойти можно избежать путем обеспечения обхода осторожно помещают и закреплены должным образом.

В долгосрочной выживаемости OLTx экспериментов, желчных протоков анастомоз считается слабое место из-за его высокой частоты осложнений 19. Желчных ткани очень хрупкие и перед особое внимание, когда обрабатывается. Многие различные методы анастомоз были описаны 5,19. Анастомоз конец-в-конец технически легко и связаны с минимальными осложнениями 19. Непрерывный шов с не-резки иглы в том числе больших участков peribiliary соединительной ткани, кажется, превосходит прерванного шва. Желчных протоков находится под ненужного напряжения, когда отдельные стежки прерванной нити завязывают. Это может привести к ткани и слез подряд утечки желчи. Шовный материал – рассасывающиеся или не рассасывающиеся – это, как правило, не важно, учитывая его ограниченный срок службы до свинья не будет прекращено. Для моделей долгосрочного выживания в течение нескольких месяцев, рассасывающиеся швы – как в человеческом OLTx – предпочтительнее.

Удельный необходимо позаботиться с послеоперационной наблюдения. Достаточное питание и подачи жидкости, надежный протокол боли, и собственно иммуносупрессииРежим обязательны. Для долгосрочных экспериментов, иммуносупрессия представляется особенно важным. По сравнению с другими млекопитающими, свиней показывают удивительно низкий процент отказов иммунологической после OLTx 20,21. Круглые клеток инфильтрации максимальны в течение второй недели после трансплантации и уменьшить спонтанно, даже без иммуносупрессии. Отказ редко причиной смерти после свиного OLTx 22. Тем не менее, даже с протоколом иммуносупрессии с участием управляющей упомянули здесь стероиды внутривенно и перорально ингибиторы кальциневрина, отторжение трансплантата указывается умеренное увеличение трансаминаз, начиная с 4 дня после OLTx и подтверждается очевидной портал поля инфильтрации вокруг клеток. Ингибиторы кальциневрина может быть дано либо перорально или внутривенно 23,24 25,26; оба метода имеют свои недостатки. Даже при пероральном СПИДа приложений, фактическое количество достижении желудочно-кишечного тракта остается неясным. С другой стороны, Непрерывная инфузия IV вручка свиньи с активной животного трудно. Следовательно, приложение IV должна быть выполнена в виде болюса, что приводит к высокой концентрации лекарственного средства вместе с пиками потенциальных токсических эффектов. Тем не менее, оба метода применения по всей видимости, позволяют долгосрочное выживание.

Подобно клинической, послеоперационный стресс язвы профилактика рекомендуется. Послеоперационный кровотечение из пептической язвы является частой проблемой, и могут быть связаны с нарушениями функции печени 27. Через несколько случаев желудочно-кишечных кровотечений в обеих группах OLTx, авторы начали регулярные профилактику пантопразола и не испытывать никакого желудочно-кишечного кровотечения с тех пор.

Строгое соблюдение стерильных условиях во время операции, сопоставимых с условиями в клинической операционной и последующих антибиотикопрофилактики, снижает риск инфекционных осложнений.

В заключение, эта статья рrovides практическая информация для установления свиной программу OLTx в условиях исследования. Достаточно самоотверженность, практика, работа в команде и важно для того, чтобы уменьшить период обучения, для получения достоверных результатов, и, чтобы сократить расходы и количество подопытных животных.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The study was supported by research grants from the Roche Organ Transplant Research Foundation (ROTRF) and Astellas. Markus Selzner was supported by an ASTS Career Development Award. Matthias Knaak was supported by the Astellas Research Scholarship. We thank Uwe Mummenhoff and the Birmingham family for their generous support.

Materials

Atropine Sulphate 15mg/30mL Rafter 8 Products 238481
Buprenorphine 0.3mg/mL RB Pharmaceuticals LDT N/A
Cefazolin 1g Pharmaceutical Partners of Canada Inc. 2237138
Cyclosporin Oral Solution 5000mg/50mL Novartis Pharmaceuticals Canada Inc. 2150697
Fentanyl Citrate 0.25mg/5mL Sandoz Canada Inc. 2240434
Heparin 10,000iU/10mL Leo Pharma A/S 453811
Isoflurane 99.9%, 250mL Pharmaceutical Partners of Canada Inc. 2231929
Ketamine Hydrochloride  5000mg/50mL Bimeda-MTC Animal Health Inc. 612316
Lactated Ringer’s + 5% Dextrose, 0.5L Baxter Corporation 61131
Lacteted Ringer’s, 1L Baxter Corporation 61085
Metronidazole 500mg/100mL Baxter Corporation 870420
Midazolame 50mg/10mL Pharmaceutical Partners of Canada Inc. 2242905
Pantoprazole 40mg Sandoz Canada Inc. 2306727
Potassium Chloride 40mEq/20mL Hospira Healthcare Corporation 37869
Propofol 1000mg/100mL Pharmascience Inc. 2244379
Protamine Sulfate 50mg/5mL Pharmaceutical Partners of Canada Inc. 2139537
Saline 0.9%, 1L Baxter Corporation 60208
Sodium Bicarbonate 50 mEq/50mL Hospira Healthcare Corporation 261998
Solu-Medrol 500mg Pfizer Canada Inc. 2367963
Tranexamic Acid 1000mg/10mL Pfizer Canada Inc. 2064413
University of Wisconsin Solution, SPS-1 Organ Recovery Systms SPS-1
Xylocaine Endotracheal 10mg/50mL AstraZeneca 2003767
Appose ULC 35W skin stapler Covidien Canada 803712
Maxon, 1 Covidien Canada 606173
Sofsilk, 0 Covidien Canada S606
Sofsilk, 2-0 Covidien Canada S405
Sofsilk, 3-0 Covidien Canada S404
Surgipro II, 4-0 Covidien Canada VP581X
Surgipro II, 5-0 Covidien Canada VP725X
Surgipro II, 6-0 Covidien Canada VP733X
Catheter i.v, 18 G BD Canada 381147
Cook TPN catheter, 9.5Fr Cook Medical Company C-TPNS-9.5-90
PSI Kit for sheath catheter, 8.5Fr Arrow International ASK-09803-UHN
Infusion Pump Line Smith Medical ASD Inc. 21-0442-25
Liver Admin Set (flush line) CardioMed Supplies Inc 17175
Mallinckrodt, Tracheal Tube, 6.5mm Covidien Canada 86449
Med-Rx Suction Connecting Tube Benlan Inc. 70-8120
Organ Bag CardioMed Supplies Inc 2990
Suction Tip Tyco Healthcare Group LP 8888501023
Valleylab, Cautery Pencil Covidien Canada E2515H
Valleylab, Patient Return Electrode Covidien Canada E7507
Bypass Connector 3/8” x 1/4“ Raumedic AG 955083-001
Bypass Connector 3/8” x 3/8” Luer Lock Raumedic AG 955163-001
Bypass Connector Y 3/8” x 3/8” x 1/4” Raumedic AG 961360-002
Bypass Tubing 1/4” x 1/16” Raumedic AG 039505-010
Bypass Tubing 3/8” x 3/32” Raumedic AG 039535-005
Rotaflow Cenrtifugal Pump Maquet-Dynamed HC 2821
Stainless Steel Hose Clamp Ring, 5mm Oetiker 16700007
Abdominal Retractor Medite GmbH N/A
De Bakey – Beck, Infrahepatic Cava Clamp Aesculap Inc. FB519R
Diethrich, Atraumaitc Clamp (Portal Vein) Aesculap Inc. FB525R
Gregory Bull Dog Clamp, curved Aesculap Inc. FB382R
Gregory Bull Dog Clamp, straight Aesculap Inc. FB381R
Potts – De Martel, Scissors Aesculap Inc. BC648R
Satinsky, Suprahepatic Cava Clamp Aesculap Inc. FB605R
Symetrical Tubing Clamp Codman Instruments 198010
Anesthesia Machine, Optimax Moduflex Anesthesia Equipment SN5180
Bypass Flow meter, HT 110 Transonic Systems Inc. HT110B11106
Flow meter probe, H6XL Transonic Systems Inc. H6Xl689
Heat Therapy Pump, T/Pump Gaymar Industries Inc TP500-G89D19
Infusion Pump 3000 SIMS Graseby LTD. SN300050447
Isoflurane Vapor 19.1 Draeger Medical Canada Inc. N/A
Monitor, Datex AS 3 Instrumentarium Corp./ Hitachi D-VHC14-23-02
Rotaflow Centrifugal Drive Unit Marquet-Dynamed 952301
Rotaflow Console Marquet-Dynamed 706035
Temperature Therapy Pad Gaymar Industries Inc TP26E
Valleylab Force Tx Valleylab Inc. 216151480
Ventilator, AV 800 DRE Medical Equipment 40800AVV
Warm Touch, Patient Warming System Nellcor/ Covidien Canada 5015300A
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mehrabi, A., Fonouni, H., Muller, S. A., Schmidt, J. Current concepts in transplant surgery: liver transplantation today. Langenbecks Arch. Surg. 393 (3), 245-260 (2008).
  2. Qiu, J., Ozawa, M., Terasaki, P. I. Liver transplantation in the United States. Clin. Transpl. , 17-28 (2005).
  3. Chalstrey, L. J. Technique of orthotopic liver transplantation in the pig. Br. J. Surg. 58 (3), 585-588 (1971).
  4. Esmaeilzadeh, M. Technical guidelines for porcine liver allo-transplantation: a review of literature. Ann. Transplant. 17 (2), 101-110 (2012).
  5. Calne, R. Y. Observations of orthotopic liver transplantation in the pig. Br. Med. J. 2 (5550), 478-480 (1967).
  6. Memsic, L., Quinones-Baldrich, W., Kaufman, R., Rasool, I., Busuttil, R. W. A comparison of porcine orthotopic liver transplantation using a venous-venous bypass with and without a nonpulsatile perfusion pump. J. Surg. Res. 41, 33-40 (1986).
  7. Torres, O. J. Hemodynamic alterations during orthotopic liver experimental transplantation in pigs. Acta. Cir. Bras. 23 (2), 135-139 (2008).
  8. Battersby, C., Hickman, R., Saunders, S. J., Terblanche, J. Liver function in the pig. 1. The effects of 30 minutes’ normothermic ischaemia. Br. J. Surg. 61 (1), 27-32 (1974).
  9. Smith, A. C., Swindle, M. M. Preparation of swine for the laboratory. Ilar. J. 47 (4), 358-363 (2006).
  10. Swindle, M. M., Smith, A. C. Best practices for performing experimental surgery in swine. J. Invest. Surg. 26 (2), 63-71 (2013).
  11. Moench, C., Moench, K., Lohse, A. W., Thies, J., Otto, G. Prevention of ischemic-type biliary lesions by arterial back-table pressure perfusion. Liver Transpl. 9 (3), 285-289 (2003).
  12. Koski, E. M., Suhonen, M., Mattila, M. A. Ultrasound-facilitated central venous cannulation. Crit. Care Med. 20 (3), 424-426 (1992).
  13. Lange, J. J., Hoitsma, H. F., Meijer, S. Anaesthetic management in experimental orthotopic liver transplantation in the pig. Eur. Surg. Res. 16 (6), 360-365 (1984).
  14. Kaiser, G. M., Heuer, M. M., Fruhauf, N. R., Kuhne, C. A., Broelsch, C. E. General handling and anesthesia for experimental surgery in pigs. J. Surg. Res. 130 (1), 73-79 (2006).
  15. Heuer, M. Liver transplantation in swine without venovenous bypass. Eur. Surg. Res. 45 (1), 20-25 (2010).
  16. Gruttadauria, S. Porcine orthotopic liver autotransplantation: facilitated technique. J. Invest. Surg. 14 (2), 79-82 (2001).
  17. Falcini, F. Veno-venous bypass in experimental liver transplantation: portal-jugular versus caval-portal-jugular. G. Chir. 11 (4), 206-210 (1990).
  18. Filipponi, F., Benassai, C., Falcini, F., Martini, E., Cataliotti, L. Biliary tract complications in orthotopic liver transplantation: an experimental study in the pig. Ital. J. Surg. Sci. 19 (2), 131-136 (1989).
  19. Terblanche, J. Orthotopic liver homotransplantation: an experimental study in the unmodified pig. S. Afr. Med. J. 42 (20), 486-497 (1968).
  20. Calne, R. Y. Prolonged survival of liver transplants in the pig. Br. Med. J. 4 (5580), 645-648 (1967).
  21. Battersby, C., Egerton, W. S., Balderson, G., Kerr, J. F., Burnett, W. Another look at rejection in pig liver homografts. Surgery. 76 (4), 617-623 (1974).
  22. Net, M. The effect of normothermic recirculation is mediated by ischemic preconditioning in NHBD liver transplantation. Am. J. Transplant. 5 (10), 2385-2392 (2005).
  23. Guarrera, J. V. Hypothermic machine perfusion of liver grafts for transplantation: technical development in human discard and miniature swine models. Transplant Proc. 37 (1), 323-325 (2005).
  24. Minor, T. Hypothermic reconditioning by gaseous oxygen improves survival after liver transplantation in the pig. Am. J. Transplant. 11 (12), 2627-2634 (2011).
  25. Kelly, D. M. Porcine partial liver transplantation: a novel model of the ‘small-for-size’ liver graft. Liver Transpl. 10 (2), 253-263 (2004).
  26. Meijer, S., Hoitsma, H. F., Visser, J. J., de Lange, J. J. Long term survival following orthotopic liver transplantation in pigs; with special reference to gastric ulcer complications. Neth. J. Surg. 36 (6), 168-171 (1984).

Tags

Porcine Liver TransplantationOrthotopic Liver TransplantationPorto-caval ShuntLiver Transplantation ModelExperimental Animal ResearchIntestinal DecompressionClinical Transplantation Practice

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Spetzler, V. N., Goldaracena, N., Knaak, J. M., Louis, K. S., Selzner, N., Selzner, M. Technique of Porcine Liver Procurement and Orthotopic Transplantation using an Active Porto-Caval Shunt. J. Vis. Exp. (99), e52055, doi:10.3791/52055 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image