Imágenes en tiempo real de la célula-célula cruces endoteliales Durante neutrófilos Transmigración Bajo Flujo Fisiológica

Los neutrófilos se aislaron a partir de voluntarios sanos que han firmado un consentimiento informado. La investigación ha sido realizada de acuerdo con las directrices institucionales y nacionales para el bienestar humano. 1. Plating y mantenimiento de umbilical humana células endoteliales de vena Células de cultivo endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) según las instrucciones del fabricante. Grow HUVECs en fibronectina (FN) presenta el revestimiento platos (10 g / ml, disueltos en agua desmineralizada) usando los medios de comunicación (medio basal endotelial (EBM-2) medio suplementado con medio de crecimiento endotelial (EGM-2) SingleQuots). Utilice cultivo celular entre 4-8 pasajes para los experimentos. Día 1: Escudo de flujo cámaras con 100 l de fibronectina (10 g / ml en PBS) durante al menos 2 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. Día 2: Cuando las células alcanzan 80-90% de confluencia, las células trypsinize después de un lavado cuidadoso con solución salina tamponada con fosfato RT (PBS) pH 7,4, centrifugar a 800 xg y resuspender a 800.000 células / ml utilizando los medios de comunicación. Placa de 80.000 células en cada canal de flujo de las cámaras recubiertas con FN y suavemente pipeta la suspensión celular arriba y abajo. Cultura O / N en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2. Día 3: Actualiza los medios de comunicación en la diapositiva flujo cámaras inclinando suavemente el portaobjetos en un ángulo de 45 °. (Véase la Figura 1A). NOTA: Se recomienda para eliminar sólo los medios de comunicación en los embalses y no en el propio canal. La eliminación de los medios de comunicación en los canales puede resultar en la pérdida de células endoteliales y la muerte debido a la fuerza de arrastre de los medios de comunicación causados ​​por pipeteo. Compruebe por microscopía de contraste de fase si las células endoteliales se han formado una monocapa (es decir, 100% de confluencia). Si las células no son 100% confluentes, cambiar los medios de comunicación dos veces al día hasta que alcanzan el 100% de confluencia. Una vez que las células han alcanzado la confluencia, estimular las células con los medios de comunicación (véase el paso1,1) que contiene mediador inflamatorio (TNF-α (10 ng / ml)). Estimular HUVECs O / N (es decir, 12 horas) con resultados TNF-α en un fenotipo inflamatorio del endotelio, es decir., Sobre regulación de moléculas de adhesión celular tales como ICAM-1 y VCAM-1 13. 2. leucocitos polimorfonucleares Aislamiento uso de gradientes de Percoll Preparar N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico (HEPES) -buffer (en adelante denominado: flujo-buffer) antes de aislar los leucocitos polimorfonucleares (PMN). Flow-tampón se utiliza para lavar PMNs aislados y como tampón en el ensayo de flujo. Para preparar flujo-buffer: diluir 7,72 g NaCl (132 mM), 4,76 g de HEPES (20 mM), 0,45 g KCl (6 mM), 0,25 g MgSO 4 • 7H 2 O (1 mM), K 2 HPO 4 • 3H 2 O (1,2 mM) en 1 L de agua desmineralizada y se ajusta a pH 7,4 (esta población puede mantenerse a 4 ° C durante varias semanas). Añadir frescos 100 l 1 M CaCl 2 y #160; (1 mM), 2,5 ml de albúmina humana a partir de una concentración de 200 g / L de stock (0,5% v / v) y 0,1 g de glucosa a 100 ml (0,1% w / v) de tampón de flujo. A continuación, un filtrado del búfer de flujo utilizando un filtro de 0,45 micras. NOTA: Este-buffer de flujo tiene que estar preparado fresco para cada experimento. Antes de aislamiento de PMN, preparar la solución de 10% de citrato trisódico (TNC) en PBS, pH 7,4. Recoger 20 ml de sangre total en vacuettes heparina de sodio de un voluntario sano. Diluir la sangre completa 1: 1 con 10% de PBS / TNC en tubos de 50 ml y 20 ml de pipeta sangre diluida cuidadosamente en 12,5 ml de Percoll (un 23% (w / w) solución coloidal en agua con una densidad de 1,130 g / ml) en un nuevo tubo de 50 ml. Con cuidado, coloque los tubos en la centrífuga y centrifugar durante 20 min a 800 xg con baja aceleración y ninguna rotura puesta a RT. NOTA: Cuando la adición de la sangre diluida a la Percoll, inclinar el tubo de Percoll que contiene en un ángulo de 45 ° y la pipeta suavemente la sangre diluida en el ingenio del tuboh el ajuste más lento pipeta chico. Eliminar todo el líquido y posteriormente llenar el tubo con eritrocitos buffer de lisis enfriado con hielo (4,15 g NH 4 Cl [0,155 M], 0,5 g de KHCO3 [0,01 M] y 18,5 mg de EDTA (Triplex III) [0,1 mM] a 500 ml de helado H 2 O) para lisar los eritrocitos. Deje el tubo en hielo, de vez en cuando invirtiendo el tubo, hasta que la suspensión se vuelve rojo oscuro, seguido de centrifugación 500 xg durante 5 min a 4 ° C con descansos habilitados. NOTA: La fracción de sedimento contiene los PMN (neutrófilos, eosinófilos, basófilos) junto con los eritrocitos. Aspirar el sobrenadante y lavar pellet dos veces en buffer de lisis enfriado con hielo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el sedimento con tampón de flujo a temperatura ambiente y determinar la concentración de PMNs utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Suspender los PMNs en el flujo-tampón a 1 x 10 6 células / ml y mantenerla en RT. 3. Etiquetado de Endotelial Junctional VE-cadherina y PECAM-1 Añadir el anticuerpo 647 PECAM Alexa Fluor (clon WM59) a una dilución 1: 100 y el anticuerpo VE-cadherina-FITC independiente de calcio (clon 55-7H1) en un medio de cultivo 1:50 dilución a HUVEC (ver paso 1.1), e incubar durante 30 min antes de iniciar el experimento de flujo de visualizar la dinámica de unión de células endoteliales durante la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo fisiológicas. NOTA: Antes de añadir los anticuerpos directamente etiquetados a los flujos de cámaras, asegúrese de que el volumen de cada canal no exceda de 100 l. Esto ayuda a mantener los gastos de anticuerpo tan bajo como sea posible. 4. PMN TEM Ensayo de Flujo Bajo Coloque los PMNs en un baño de agua durante 15 min a 37 ° C antes de su inyección en el sistema de flujo. Conecte el tubo a un flujo-cámara vacía y llénela con agua caliente (por ejemplo, 37 ° C) Caudal-buffer (véase el paso 4.3) para evitar la formación de burbujas de aire al configurar ªsistema de flujo e. Conectar un lado de una cámara vacía de flujo para el sistema de flujo de la bomba de jeringa mediante el uso de tubo de silicona que contiene una jeringa de 20 ml, y poner la cámara de flujo en la platina del microscopio. Conectar el otro lado de un flujo de la cámara de vacío al matraz depósito lleno de 37 ° C-tampón de flujo (Figura 1B) y comenzar la bomba de jeringa con el fin de llenar todo el tubo con tampón de flujo. La bomba se tire el flujo de tampón desde el depósito a través de la cámara de flujo dentro de la jeringa. NOTA: Este tubo también contiene un puerto de inyección en línea Luer, que permite a los PMNs a inyectar con una aguja en un experimento de funcionamiento sin detener el flujo y la creación de burbujas de aire. Vuelva a colocar el flujo de la cámara de vacío con la cámara de flujo que contiene las HUVEC tratadas con TNF-α, conecte el tubo que contiene el flujo-buffer-y colocarla en la platina del microscopio (Figura 1C). Pellizque de los tubos antes de desconectar y volver a conectar elm a las cámaras que contienen el HUVECs, ya que no pellizcando puede resultar en la formación de burbujas de aire dentro de la tubería y / o de flujo cámaras. Ajustar la velocidad de flujo a 1 dyn / cm 2, de acuerdo con la velocidad de flujo fisiológico en vénulas capilares enviar (1-5 dyn / cm 2). Registro de contraste de interferencia diferencial (DIC), FITC (488 nm) y Alexa Fluor 647 (647 nm) simultáneamente usando un microscopio de escaneo láser confocal. Inyectar los PMNs (paso 4.1) lentamente en el sistema de flujo a través de la in-line Luer puerto de inyección (Figura 1D) utilizando jeringuillas de 1 ml. Después de unos minutos, aparecen los leucocitos, se adhieren, y transmigrar. Pare el experimento en cualquier momento deseado desconectando el tubo de la cámara de flujo y fijador de pipeteado (3,7% de formaldehído en PBS) en la cámara de flujo-. Permitir la fijación durante 10 min, seguido de lavado con PBS. Los datos se analizan usando el software de formación de imágenes (ver materiales y equipos de mesa). NOTA: Realice la que experimento usando un microscopio de barrido de láser confocal equipado con una cámara climática con una temperatura constante a 37 ° C, 5% de CO 2, y un objetivo 63X de aceite.