好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

好中球は、インフォームドコンセントに署名した人の健康なボランティアから単離した。研究が人類の福祉のための制度や国のガイドラインを遵守して行われている。 ヒト臍帯静脈内皮細胞の1めっきとメンテナンス製造業者の指示に従って培養ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECを）。フィブロネクチン上のHUVECを育てる（FN）がメディアを使用して（脱イオン水に溶解した10μg/ mlの）料理がコーティングされ（内皮増殖培地（EGM-2）singlequotsを加えた内皮基本培地（EBM-2）培地）。実験のために4-8の通路の間に細胞培養を使用してください。 1日目：37℃で少なくとも2時間、5％CO 2のためにフィブロネクチンを100μl（PBS中10μg/ ml）を有するコート、フローチャンバー。 2日目：細胞を、80〜90％コンフルエンスに達し、RTリン酸緩衝生理食塩水（で慎重に洗浄した後、細胞をトリプシン処理PBS）pH7.4のメディアを使用して、800,000細胞/ mlで800×gで遠心分離し、再懸濁。プレートFNでコーティングされたフローチャンバーのすべての単一のチャネル80,000細胞、ゆっくり上下細胞懸濁液をピペット。 37℃のインキュベーター中、5％CO 2で培養O / N。 3日目：優しく45°の角度でスライドを傾けてフローチャンバースライドでメディアを更新します。 （ 図1Aを参照）。 メモ：のみ貯水池ではなく、チャネル自体のメディアを削除することを推奨します。チャンネル内のメディアの除去が原因ペッティングによって引き起こされるメディアのドラッグ力に内皮細胞の損失と死に至ることがある。 内皮細胞単層（ すなわち、100％コンフルエント）を形成した場合、位相差顕微鏡により確認してください。細胞が100％コンフルエントでない場合、彼らは100％のコンフルエンスに達するまで、メディアを2回日を変更する。 細胞がコンフルエントに達したら、培地で細胞を刺激する（ステップを参照1.1）炎症性メディエーター（TNF-α（10 ngの個/ ml）を含有する）。 、内皮の炎症性表現型をTNF-αの結果とHUVECをO / N（ すなわち、12時間）刺激すなわち 、アップレギュレーションなどのICAM-1およびVCAM-1の13のような細胞接着分子。 パーコール勾配を使用した2。多形核白血球の単離多形核白血球（PMN）を単離する前に：（フローバッファー以下と呼ばれる）、N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸（HEPES）を調製-buffer。フローバッファを単離したPMN及びフローアッセイにおけるバッファとしての洗浄に使用される。フローバッファを準備するには：7.72グラムのNaCl（132 mM）を、4.76グラムのHEPES（20 mM）を、0.45グラムのKCl（6 mM）を、0.25グラムの硫酸マグネシウム•7H 2 O（1 mM）を、K 2 HPO 4•3Hを希釈脱イオン水1L中2 O（1.2ミリモル）と（この在庫が数週間、4℃で保持することができる）pH7.4に調整します。 新鮮な100μlの1Mの塩化カルシウム＆＃を追加します。160;が​​200g / Lのストック濃度から（1 mM）を2.5 mlのヒトアルブミン（0.5％v / v）およびフロー緩衝液100ml（w / vの0.1％）、0.1グラムのグルコース。次に、0.45μmのフィルターを用いて、フローのバッファをフィルタリングします。注：このフローバッファは、すべての実験のために新たに調製する必要があります。 PMNの単離の前に、10％のクエン酸三ナトリウム（TNC）PBS、pH7.4中の溶液を調製。 健康なボランティアからのナトリウムヘパリンのvacuettes全血を20mlを収集します。パーコールの12.5ミリリットル（1.130グラム/ mlの密度で、水中の23％（w / w）のコロイド溶液）の上に慎重に、血液を希釈して50mlチューブとピペット20mlの10％PBS / TNCで1：全血の1に希釈新しい50mlチューブ中。慎重に遠心機でチューブを配置し、低加速し、RTで設定されていないブレークで800×gで20分間スピン。 注：パーコールに希釈した血液を追加する場合は、45度の角度でパーコール含有チューブを傾け、静かにチューブのウィットに希釈血液をピペットH最も遅いピペット男の子の設定。 すべての液体を除去し、続いて500ミリリットルに氷冷した赤血球溶解バッファー（4.15グラムのNH 4 Clを[0.155 M]、0.5gのKHCO 3 [0.01 M]及び18.5ミリグラムEDTA（三重III）[0.1 mm]としたチューブを埋める赤血球を溶解するための氷冷H 2 O）である。サスペンションが有効になって休憩して、4℃で5分間の遠心分離500×gで、続いて暗赤色に変わるまで、時折転倒、氷上でチューブのままにしておきます。 注：ペレット画分を一​​緒に赤血球とのPMN（好中球、好酸球、好塩基球）が含まれています。 上清を除去し、4℃で5分間500×gで氷冷溶解 – 緩衝液中で2回ペレットを洗浄。 RTで流れバッファーでペレットを再懸濁し、血球計または自動細胞カウンターのいずれかを使用してPMNの濃度を決定する。 1×10 6細胞/ mlで、フローバッファ内のPMNをサスペンドし、室温で保管してください。 内皮ジャンクショ​​ンの3ラベリングアルは、VE-カドヘリンおよびPECAM-1 1でPECAMアレクサフルオロ647抗体（クローンWM59）を追加します。1:50希釈HUVECに、培地で100倍希釈し、カルシウム非依存VE-カドヘリン-FITC抗体（クローン55-7H1）、（ステップ1.1参照）前生理的流れの条件下で好中球遊走の間に内皮細胞の接合動態を可視化するために、フロー実験を開始する30分間インキュベートする。 注：フローチャンバーに直接標識抗体を追加する前に、各チャネルのボリュームは100μLを超えていないことを確認してください。これは、可能な限り低い抗体費を維持するのに役立ちます。 4 PMN TEMアッセイで流動前のフローシステムにそれらを注入する37℃で15分間水浴中にPMNを配置してください。 目を設定する際の気泡の形成を防止する（ステップ4.3参照）、空のフローチャンバーにチューブを接続し、暖かいでいっぱいに（ 例えば、37℃）、フローバッファ電子フローシステム。 20ミリリットルの注射器を含むシリコーンチューブを使用して、シリンジポンプフローシステムに空のフローチャンバーの一方の側を接続し、顕微鏡のステージへの流れチャンバを置く。 37°Cフロー緩衝液（ 図1B）で満たされたリザーバフラスコに空のフローチャンバの反対側を接続し、フローバッファーですべてのチューブを充填するために、シリンジポンプを起動する。ポンプは、注射器に流動室を通ってリザーバから流れバッファを引っ張ってくる。注：このチューブはまた、PMNの流れを停止させ、気泡を作成せずに実行している実験に針を注入することを可能にする、インラインルアー注入ポートが含まれています。 フローチャンバーを含むTNF-αで処理したHUVECを持つ空のフローチャンバーを交換し、フローバッファーを含むチューブを接続し、顕微鏡ステージ（ 図1C）に置きます。切断して再接続する前に、チューブを切っピンチピンチオフしないように、HUVECを含有するチャンバーmは、チューブおよび/またはフローチャンバ内の気泡の形成をもたらすことができる。 ポスト毛細管細静脈において生理的流れ速度に応じて、1ダイン/ cm 2の流速を調整する（1-5ダイン/ cm 2）であった。 レコード微分干渉コントラスト（DIC）、FITC（488nmの）およびアレクサフルオロ647（647 nm）を同時に共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて。 1ミリリットルの注射器を使用して、インラインルアー注入口（ 図1D） を介して 、フローシステム内にゆっくりのPMN（ステップ4.1）を注入する。 数分後、白血球が付着現れ、転生。フローチャンバー内にフローチャンバー及びピペッティング固定液（PBS中3.7％ホルムアルデヒド）からチューブを外して、任意の瞬間に実験を停止します。 10分間の固定を可能にし、PBSで洗浄した。データは、（材料および機器の表を参照）画像ソフトウェアを用いて分析される。 NOTE：37°C、5％CO 2の恒温及び63X油を目的とした人工気象室を備えた共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて彼の実験を実行する。