JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Real-time beeldvorming van endotheelcellen-cel Junctions Tijdens Neutrophil Transmigration onder fysiologische Flow

Published: August 14, 2014
doi:
10.3791/51766
, , ,
1Department of Molecular Cell Biology,Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, AMC at University of Amsterdam

Summary

Leukocyten steken de endotheelcellen monolaag met behulp van de paracellulaire of de transcellulaire route. We ontwikkelden een eenvoudige test om te volgen de verdeling van endogene junctionele VE-cadherine en PECAM-1 tijdens de migratie van leukocyten onder fysiologische stroom te maken tussen de twee transmigratie routes.

Abstract

Tijdens een ontsteking, leukocyten verlaat de bloedsomloop en steek het endotheel te vechten binnendringende ziekteverwekkers in onderliggende weefsels. Dit proces staat bekend als de migratie van leukocyten. Twee routes leukocyten aan endotheelcellen monolaag steken beschreven: de paracellulaire route, bijvoorbeeld via de cel-cel verbindingen en de transcellulaire route, bijvoorbeeld via de endotheliale cel lichaam. Het is echter technisch moeilijk om onderscheid tussen parameters en transcellulaire route. We ontwikkelden een eenvoudige in vitro assay te gaan wat de verdeling van endogeen VE-cadherine en PECAM-1 tijdens neutrofielen transendotheliale migratie onder fysiologische stroomomstandigheden. Vóór neutrofielen perfusie werden endotheelcellen kort behandeld met fluorescent gelabelde antilichamen tegen VE-cadherine en PECAM-1. Deze antilichamen niet interfereren met de functie van beide eiwitten, zoals bepaald door elektrische cel Voedingssubstraatte impedantiedetectie- en FRAP metingen. Met behulp van deze test, waren we in staat om te volgen de verdeling van endogene VE-cadherine en PECAM-1 tijdens transendotheliale migratie onder stromingscondities en onderscheid te maken tussen de parameters en transcellulaire trekroutes van de leukocyten door het endotheel.

Introduction

Efficiënte en strak gecontroleerde migratie van leukocyten (TEM) is van groot belang in de fysiologische processen zoals immuunsurveillance en acute ontsteking. Onder bepaalde patho-fysiologische omstandigheden en ongecontroleerde overmatige TEM wordt waargenomen als gevolg chronische ontstekingsziekten (bijvoorbeeld reumatoïde artritis, atherosclerose, astma). Ook tijdens tumorcel metastase, het proces van transendotheliale migratie backing voor tumorcellen om de circulatie metastaseren 1-3 verlaten. Om specifiek interfereren met overmatige leukocyten of tumorcel TEM, is een gedetailleerd inzicht in de regulatie van dit proces vereist.

Aangenomen wordt dat het TEM proces vindt via verschillende stappen. Rudimentaire studies, beoordeeld twee decennia geleden door Butcher en Springer, leidde tot de multistep model beschrijft het proces van TEM 4,5. Dit model is nog steeds zo, hoewel sommige advertentiemende stappen zijn opgenomen 6. Alon et al. Beschreven de noodzaak de aanwezigheid van geïmmobiliseerde chemokinen op het oppervlak van het endotheel 7. Onlangs toonden ze aan dat de endotheel zelf genereert chemokinen die worden gepresenteerd op het endotheel apicale oppervlak 8. Bovendien is het dezelfde groep naar voren gebracht het belang van de stromingscondities tijdens TEM 7. Onlangs, kunnen verscheidene publicaties gericht op de twee verschillende routes leukocyten opbrengst bij de laatste fase van diapedesis TEM. Ze kunnen ofwel gaan door de cel-cel contacten, dat wil zeggen, de paracellulair trekroute, of doorkruisen de endotheelcellen lichaam, bekend als de transcellulaire trekroute 9. Carman en collega's bestudeerden deze routes in detail en concludeerden dat leukocyten kiest bij voorkeur de paracellulair trekroute (90%) over de transcellulaire route (10%) bij het ​​overschrijden van een navelstreng endotheel monolaag 10.Wanneer endotheelcellen uit andere landen gebruikt, bijvoorbeeld hersenen of microvasculatuur, meer leukocyten gebruikten de transcellulaire route (30%) 11. De Vestweber groep onlangs gebleken dat wanneer de cel-cel verbindingen konden scheiden van elkaar door middel van een knock-in diermodel vervangen endogene VE-cadherine een VE-cadherine-alfa-catenine chimeer werd leukocyt TEM volledig geblokkeerd 12 . Verrassenderwijs de auteurs merkten dat TEM werd geblokkeerd in verscheidene, maar niet alle, weefsels. Over het algemeen zijn deze elegante experimenten aangegeven dat leukocyten voorkeur de paracellulaire route over de transcellulaire route, hoewel de regulerende signalen dat dit besluit leiden zijn nog onbekend.

Hoewel de meerderheid van de leukocyten voorkeur de paracellulaire route migratie, blijft het moeilijk om onderscheid tussen beide routes. Trouwens, ondanks diverse studies gericht op de rol van de endotheelcel-cel junctionen, de dynamiek van deze verbindingen, met name de junctionele eiwitten VE-cadherine en PECAM-1 tijdens leukocyt crossing nog ter discussie. We ontwikkelden een relatief eenvoudige assay waarin deze kruising moleculen kunnen in real-time tijdens leukocyt diapedesis onder fysiologische stroomomstandigheden met fluorescent gemerkte antilichamen. Deze antilichamen niet interfereren met of blokkeren junctional integriteit of de mobiliteit van de beoogde eiwitten. Deze test kunnen we de dynamiek van junctionele eiwitten tijdens het proces van paracellulaire TEM volgen. Bovendien, deze test maakt het ook mogelijk onderscheid te maken tussen de parameters en transcellulaire migratieroutes.

Protocol

Neutrofielen werden geïsoleerd uit gezonde vrijwilligers die een informed consent hebben getekend. Onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele en nationale richtlijnen voor het menselijk welzijn. 1 Plating en onderhoud van humane navelstreng endotheelcellen Cultuur humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) volgens de instructies van de fabrikant. Groeien HUVECs op fibronectine (FN) -gecoate gerechten (10 ug / ml, opgelost in gedemineraliseerd water) met media (Endotheliale Basal Medium (EBM-2) medium aangevuld met Endothelial Growth Medium (EGM-2) singlequots). Gebruik celcultuur tussen 4-8 passages voor experimenten. Dag 1: Coat stroom-kamers met 100 ul van fibronectine (10 ug / ml in PBS) gedurende ten minste 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Dag 2: Wanneer cellen 80-90% confluentie bereikt, trypsinize de cellen na zorgvuldig wassen met RT fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4, centrifuge bij 800 xg en resuspendeer bij 800.000 cellen / ml met behulp van de media. Plaat 80,000 cellen in elk kanaal van het FN-beklede stroom-kamers en voorzichtig pipetteren de celsuspensie op en neer. Cultuur O / N in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2. Dag 3: Vernieuwen van de media in de stroom-kamer dia door voorzichtig kantelen van de glijbaan in een hoek van 45 °. (Zie figuur 1A). OPMERKING: Het wordt aanbevolen om alleen de media te verwijderen in de reservoirs en niet in het kanaal zelf. Verwijdering van de media in de kanalen kan in endotheelcellen verlies en sterfte door het slepen kracht van de media veroorzaakt door pipetteren. Controleer door fasecontrast microscopie als de endotheelcellen een monolaag (dwz 100% confluent) gevormd. Als de cellen niet 100% confluent, de opslaglocatie tweemaal daags tot ze 100% confluentie bereikt. Nadat de cellen confluentie hebben bereikt, stimuleren de cellen met media (zie stap1.1) die ontstekingsmediatoren (TNF-α (10 ng / ml)). Stimuleren HUVECs O / N (dwz 12 uur) met TNF-α resulteert in een inflammatoire fenotype van het endotheel, dwz., Up-regulatie van adhesiemoleculen zoals ICAM-1 en VCAM-1 13. 2 Polymorfonucleaire Leukocyte Isolatie Met behulp Percoll Verlopen Bereid N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethaansulfonzuur (HEPES) -buffer (hierna te noemen: stroom-buffer) voor het isoleren van polymorfonucleaire leukocyten (PMN). Flow-buffer wordt gebruikt voor geïsoleerde PMN wassen en als buffer in de stroom assay. Om stroom-buffer bereid: verdun 7,72 g NaCl (132 mM), 4,76 g HEPES (20 mM), 0,45 g KCl (6 mM), 0,25 g MgSO 4 • 7H 2 O (1 mM), K 2 HPO 4 • 3H 2 O (1.2 mM) in 1 L gedemineraliseerd water en PH 7,4 (dit bestand kunnen bij 4 ° C bewaard gedurende enkele weken). Voeg vers 100 ul 1 M CaCl2 & #160, (1 mM), 2,5 ml humaan albumine uit 200 g / L voorraadconcentratie (0,5% v / v) en 0,1 g glucose 100 ml (0,1% g / v) van stroom-buffer. Vervolgens filter de stroom-buffer met een 0,45 urn filter. OPMERKING: Deze stroom-buffer moet vers voor elk experiment worden voorbereid. Voorafgaand aan isolatie van PMN, bereid 10% trinatriumcitraat (TNC) opgelost in PBS, pH 7.4. Verzamel 20 ml volledig bloed in natrium heparine vacuettes van een gezonde vrijwilliger. Verdun volbloed 1: 1 met 10% PBS / TNC in 50 ml buizen en Pipetteer 20 ml verdund bloed voorzichtig op 12,5 ml Percoll (een 23% (w / w) colloïdale oplossing in water met een dichtheid van 1,130 g / ml) in een nieuwe buis van 50 ml. Plaats voorzichtig de buizen in de centrifuge en spin gedurende 20 min bij 800 xg met lage versnelling en geen breuk vastgesteld bij KT. OPMERKING: Bij het toevoegen van de verdunde bloed naar de Percoll, kantel de Percoll bevattende buis in een hoek van 45 ° en voorzichtig pipet het verdunde bloed in de buis with de langzaamste pipet jongen instelling. Verwijder alle vloeibare en vervolgens vul de buis met ijskoude erytrocyt lysis-buffer (4,15 g NH4Cl [0.155 M], 0,5 g KHCO 3 [0,01 M] en 18,5 mg EDTA (triplex III) [0,1 mM] 500 ml ijskoude H2O) om erytrocyten te lyseren. Een buis op ijs, soms de buis om tot de suspensie wordt donkerrood, gevolgd door centrifugatie 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C met onderbrekingen ingeschakeld. OPMERKING: De pellet fractie bevat de PMN (neutrofielen, eosinofielen, basofielen) met de erythrocyten. Verwijder de supernatant en was pellet tweemaal in ijskoude lysis-buffer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet met stroom-buffer bij RT en bepalen PMN concentratie met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde cel teller. Suspendeer de PMNs in flow-buffer bij 1 x 10 6 cellen / ml en bewaar bij kamertemperatuur. 3 Etikettering van endotheliale Junctional VE-cadherine en PECAM-1 Voeg de PECAM Alexa Fluor 647 antilichaam (kloon WM59) bij een 1: 100 verdunning en de calcium-onafhankelijke VE-cadherine-FITC antilichaam (kloon 55-7H1) bij een 1:50 verdunning HUVEC kweekmedium (zie stap 1.1) en incubeer gedurende 30 minuten vóór het starten van de stroming experiment junctional dynamiek van endotheelcellen zichtbaar in neutrofielen transmigratie onder fysiologische stroomomstandigheden. OPMERKING: Voor het toevoegen van de direct-gelabelde antilichamen om de stroom-kamers, zorgen ervoor dat het volume van elk kanaal niet meer dan 100 ul. Dit helpt zo laag mogelijk te houden het antilichaam kosten. 4 PMN TEM Assay Onder Flow Plaats de PMNs in een waterbad gedurende 15 minuten bij 37 ° C voordat ze te injecteren in de stroom-systeem. Sluit de slang een lege stroom-kamer en vul met warme (bijvoorbeeld 37 ° C) stroom-buffer (zie stap 4.3) om de vorming te beletten van luchtbellen bij het ​​opzetten the stroomsysteem. Sluit de ene kant van een lege stroom-kamer naar de injectiepomp stroomsysteem met behulp van siliconen catheter met een spuit van 20 ml, en zet de stroom-kamer in de microscoop podium. Sluit de andere zijde van een lege stroom-kamer naar de reservoir kolf gevuld met 37 ° C stroom-buffer (Figuur 1B) en start de spuitpomp teneinde de buis met stroom-buffer te vullen. De pomp zal de stroom-buffer van het reservoir te trekken door de stroom-kamer in de spuit. Opmerking: Deze buis bevat ook een in-line Luer injectiepoort, waardoor PMNs worden geïnjecteerd met een naald in een experiment uitgevoerd zonder stoppen van de stroom en het creëren luchtbellen. Vervang de lege stroom-kamer met de stroom-cupje met TNF-α-behandelde HUVECs, sluit de stroom-buffer met slang en plaats deze in de microscoop podium (figuur 1C). Knijp uit de buizen voor het loskoppelen en opnieuw aansluiten van dem de kamertjes met de HUVEC, als niet afknijpen kan resulteren in de vorming van luchtbellen in de slang en / of stroom-kamers. Stel de stroomsnelheid 1 dyn / cm 2, overeenkomstig fysiologische stroomsnelheid in post capillaire venulen (1-5 dyn / cm 2). Record Differentieel Interferentie Contrast (DIC), FITC (488 nm) en Alexa Fluor 647 (647 nm) tegelijk met behulp van een confocale laser scanning microscoop. Injecteer de PMN (stap 4.1) langzaam in de stroom-systeem via de in-lijn Luer injectiepoort (figuur 1D) met 1 ml injectiespuiten. Na een paar minuten, leukocyten verschijnen, zich te houden, en transmigreren. Het experiment op elk gewenst moment bij het loskoppelen van de slang van de stroom-kamer en pipetteren fixeermiddel (3.7% formaldehyde in PBS) in de stroom-kamer. Laat fixatie gedurende 10 min, gevolgd door wassen met PBS. De gegevens worden geanalyseerd met beeldverwerkingssoftware (zie materialen en apparatuur tabel). Opmerking: Voer de proef hij met een confocale laserscanning microscoop voorzien van een klimaatkamer met een constante temperatuur bij 37 ° C, 5% CO2 en een 63x olie-objectief.

Representative Results

We hebben eerst getest of de antilichamen niet interfereren met de barrière functie van het endotheel. Wij meten de weerstand van endotheliale monolagen met elektrische cel-substraat impedantiedetectie (ECIS). Zie Van Buul et al. Nr 13 weerstandsverandering werd waargenomen wanneer de anti-VE-cadherine fluorescentie-gemerkt antilichaam werd toegevoegd aan de cellen (Figuur 2A). Een anti-VE-cadherine antilichaam dat is welbekende blokkeren VE-cadherin functie verminderde de weerstand aanzienlijk (figuur 2A). Ook de antilichamen voor beeldvorming kan de dynamiek van niet veranderen VE-cadherine, zoals werd beoordeeld door het meten van fluorescentie herstel na foto-Afdruk (FRAP) van VE-cadherine-GFP (Figuur 2B). Na 1-2 min, neutrofielen gehecht aan de geactiveerde endotheliale monolaag als kan worden gevisualiseerd in de DIC kanaal (Figuur 3A). Na kruipen voor 5-30 sec, de overgrote meerderheid van neutrofielen transmigrated via endotheliale monolaag door de cel-cel verbindingen die werden gelabeld met antilichamen tegen PECAM-1 en VE-cadherin. Tijdens het proces van diapedesis de verdeling van VE-cadherine en PECAM-1 werd in real-time (Figuur 3B). Op plaatsen van neutrofielen diapedesis, VE-cadherine werd lokaal verstoord en PECAM-1 toonde een meer ring-achtige structuur. Na voltooiing van diapedesis, de knooppunten nauwe en VE-cadherine en PECAM-1 duidelijk verplaatst op de plaatsen van diapedesis (figuur 3C). Merk op dat delen van de anti-PECAM-1 antilichaam werden gedetecteerd op het oppervlak van neutrofielen als de neutrofielen tot de baso-laterale zijde van het endotheel. Dit leidde echter niet voorkomen dat neutrofielen uit het oversteken van het endotheel. De waargenomen dynamiek van VE-cadherine in real-time tijdens neutrofielen transendotheliale migratie waren in overeenstemming met het werk van Shaw en collega's dietoonde middels confocale microscopie en VE-cadherine-GFP-getransfecteerde endotheelcellen, dat VE-cadherine-GFP diffuus lateraal wanneer leukocyten stak de endotheliale cel-cel verbindingen 14. Werken ook door Su en collega's onderstreept onze observaties van PECAM-1. Zij toonden aan dat, naast de laterale VE-cadherin diffusie op leukocyt passage werd PECAM-1 plaatselijk herverdeeld in een ring rond de verhuizende neutrofiel 15. Figuur 1 In vitro stroom kamer. (A) De pijl geeft het reservoir waaruit het medium moet worden vernieuwd. (B) Silicone slangen die de stroom kamer verbindt met de in-line Luer injectiepoort voor injectie PMN zonder ontregeling buis (pijlpunt). (C) Connectie van een lege stroom-kamer naar de reservoir fles gevuld met 37 ° C stroom-buffer (pijlpunt). (D) Verbinding van de stroom-kamer met het TNF-α-behandelde HUVEC de stroom-buffer bevattende buizen en in de microscooptafel (pijlpunt). Figuur 2 VE-cadherine antilichamen niet interfereren met junctions dynamics of functie. (A) van endotheelcellen monolayer impedantie wordt gemeten met ECIS. Y-as expressie impedantie in Ohm en x-as de tijd in uren. VE-cadherine antilichaamkloon 55-7H1, gelabeld met Alexa647 (blauwe lijn) of isotype IgG-Alexa647 controle (rode lijn) niet endotheelcellen monolaag impedantie niet veranderen, terwijl de VE-cadherine blokkerende antilichaam CL75 (zwarte lijn) heeft het verminderen van de impedantie . (B </strong>) VE-cadherine-GFP expressie in HUVEC en FRAP analyse met behulp van confocale microscopie liet geen verandering in fluorescentie herstel in aanwezigheid of afwezigheid van de VE-cadherine 55-7H1 antilichaam. Figuur 3 VE-cadherine en PECAM-1 verdeling in neutrofielen TEM in real-time. (A) neutrofielen (aangegeven met witte lijn) hechten aan het endotheel en die de cel-cel knooppunt zonder dat de verdeling van VE-cadherine en PECAM -1. (B) Neutrophil oversteken van de endotheelcellen monolaag door de cel-cel contacten. Een lokale dispersie van VE-cadherine en PECAM-1 kan worden waargenomen wanneer een neutrofielen steekt door de cel-cel contacten. Witte lijn illustreert aanwezigheid neutrofiel nog bovenop het endotheel. Gele lijn toont neutrofielen membraan that is al onder endotheel. (C) Neutrophil volledig stak de endotheelcellen monolaag. VE-cadherine en PECAM-1 worden verplaatst op plaatsen van diapedesis. Gele lijn toont de grenzen van de transmigrated neutrofielen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

Voor dit protocol is het essentieel om de vorming van luchtbellen in de stroom-kamers voorkomen, aangezien dit leidt tot apoptose en een verstoord monolaag. Om dit te voorkomen, willen we benadrukken bijzondere belang stappen 4.2 en 4.5, waarbij de buizen zijn verbonden met de stroom-kamer betaalt. Een kritische stap in het protocol is de priming van de PMNs die bij kamertemperatuur worden bewaard door incuberen gedurende 15-30 minuten bij 37 ° C voordat ze te injecteren om de stroom-kamer (stap 4.1). Dit resulteert in priming van leukocyten integrinen, waardoor ze zich aan adhesiemoleculen zoals ICAM-1 of VCAM-1 op endotheel.

Dit protocol is niet beperkt tot de transmigratie van neutrofielen bestuderen. Ook andere leukocyt zoals monocyten of lymfocyten worden gebruikt. Merk op dat de stap 4.1, dat wil zeggen, het vullen van de leukocyten kan verschillen tussen soorten leukocyten. Ook kunnen andere typen endotheelcellen worden gebruikt. Hiervoor is het van cruciaal belang blijftde endotheelcellen stimuleren met geschikte inflammatoire stimuli zoals TNF-α of IL-1β. Wanneer neutrofielen niet reageren verhuizende, kan men overwegen de behandeling neutrofielen kort (5 min) met N-formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-fenylalanine (fMLP) peptide 16. Dit zal de neutrofielen stimuleert, in het bijzonder hun integrines, nog verder, waardoor ze meer kans om zich te houden aan het endotheel.

Typisch 1 dyn / cm 2 stroomsnelheid wordt gebruikt. Deze stroomsnelheid wordt gemeten in post-capillaire venulen, plaatsen waar de meeste leukocyten migratie gebeurt 17. De beschreven stroom-kamers is het mogelijk om stroomsnelheid tot 10 dyn / cm 2 verhogen. Het is echter afgeraden het shear toenemen. Dit kan leiden tot ongewenste lekkage van de slang en de onthechting van de cellen van de stroom-kamer.

De in figuur 3 beschreven resultaten geven aan dat dezeantilichamen kunnen worden gebruikt voor het visualiseren en de dynamiek van endotheliale cel-cel contacten tijdens leukocyt diapedesis. In het bijzonder, naast de bestaande transmigratie assays dit protocol laat het paracellulaire van transcellulaire migratie onderscheiden onder fysiologische stroomomstandigheden in real-time. Aangezien de antilichamen vlekken de cel-cel contacten, kan men het aantal leukocyten dat VE-cadherine / PECAM-1-positieve junctions passeren versus nonpositive VE-cadherine / PECAM-1 spots scoren. Zo transcellulaire migratie kan worden onderscheiden van paracellulaire migratie.

Het is belangrijk te onderstrepen dat deze antilichamen niet interfereren met de functie van de eiwitten die binden aan: de PECAM-1 antilichaam dat bij deze studie is gericht tegen de tweede extracellulaire domein. Endotheliale cellen die waren uitgeplaat in de aanwezigheid van het antilichaam geen gebreken in verspreiding en de vorming van een monolaag vertonen, suggereert dat het antilichaam althans nietinterfereren met homotypische interacties tussen endotheliale cellen. in aanvulling op dat, doe beide antilichamen niet het vermogen van neutrofielen te migreren door de endotheelcellen monolaag aantasten. Bovendien is het aantal neutrofielen dat transmigreren over de endotheliale monolaag in afwezigheid of aanwezigheid van de antilichamen niet veranderd (gegevens niet getoond). Belangrijk confocale laser scanning microscopie geeft de mogelijkheid verschillende fluorescentie en DIC kanalen tegelijkertijd op te nemen.

Dus deze test maakt het bestuderen van de dynamica van VE-cadherine en PECAM-1 op hetzelfde moment dat een neutrofielen kruist de endotheliale cel-cel junction en helpt te begrijpen waarom leukocyten kiezen route over de andere, dwz paracellulaire versus transcellulaire.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
μ-Slide VI IBIDI 80606 Flow-chamber
0.45 μm filter  Whatman/GE Lifesciences 10462100
1 mL syringe  BD Plastipak 300013
20 mL syringe  BD Discardit II 366296
21G needle  BD Microlance 301155
Albumin  Sanquin 15522644
Ammunium chloride (NH4Cl) Merck 1009245000
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich 449709
EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors Lonza CC-3156 + CC-4176 media
EDTA (Titriplex III) Merck 1370041000
Falcon tubes  Corning Life Sciences 352096
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141-2MG FN
Glucose Sigma-Aldrich G7528
HEPES Sigma-Aldrich H3375
In-line Luer Injection port  IBIDI 10820
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) Merck 105886
PECAM-1-ALEXA-647  BD Pharmingen 561654 clone WM59
stock concentration 0.1mg/mL
Percoll  GE Healthcare Life Sciences 17-0891-09
Phosphate Buffered Saline Fresenius Kabi  Nederland M090001/01NL PBS
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Potassium hydrogen carbonate (KHCO3) Merck 1048540500
Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4) Sigma-Aldrich P5504
Silicone Tygon 3350 tubing VWR 228-4331 tubing
Sodium chloride (NaCl) Calbiochem (Millipore) 567441
Syringe pump  Harvard Apparatus model number 55-5920
TNFα  Peprotech 300-01A tumor necrosis factor
trisodium citrate  Merck 1.06447.5000 TNC
Vacuettes Greiner, Germany 980044
VE-Cadherin-FITC  BD Pharmingen 560411 clone 55-7H1 stock concentration 0.5mg/mL
Zeiss LSM510 META  Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany
Zen Software 2008 Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ross, R. Atherosclerosis–an inflammatory disease. N. Engl. J. Med. 340, 115-126 (1999).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).
  3. Szekanecz, Z., Koch, A. E. Vascular involvement in rheumatic diseases: ‘ vascular rheumatology. Arthritis Res. Ther. 10, 224 (2008).
  4. Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67, 1033-1036 (1991).
  5. Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76, 301-314 (1994).
  6. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
  7. Cinamon, G., Shinder, V., Shamri, R., Alon, R. Chemoattractant signals and beta 2 integrin occupancy at apical endothelial contacts combine with shear stress signals to promote transendothelial neutrophil migration. J. Immunol. 173, 7282-7291 (2004).
  8. Shulman, Z., Cohen, S. J., Roediger, B., et al. Transendothelial migration of lymphocytes mediated by intraendothelial vesicle stores rather than by extracellular chemokine depots. Nat. Immunol. 13, 67-76 (2012).
  9. Carman, C. V., Springer, T. A. Trans-cellular migration: cell-cell contacts get intimate. Curr. Opin. Cell Biol. 20, 533-540 (2008).
  10. Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J. Cell Biol. 167, 377-388 (2004).
  11. Millan, J., Hewlett, L., Glyn, M., et al. Lymphocyte transcellular migration occurs through recruitment of endothelial ICAM-1 to caveola- and F-actin-rich domains. Nat. Cell Biol. 8, 113-123 (2006).
  12. Schulte, D., Kuppers, V., Dartsch, N., et al. Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability. EMBO J. 30, 4157-4170 (2011).
  13. Buul, J. D., Mul, F. P., van der Schoot, C. E., Hordijk, P. L. ICAM-3 activation modulates cell-cell contacts of human bone marrow endothelial cells. J. Vasc. Res. 41, 28-37 (2004).
  14. Shaw, S. K., Bamba, P. S., Perkins, B. N., Luscinskas, F. W. Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium. J. Immunol. 167, 2323-2330 (2001).
  15. Su, W. H., Chen, H., Jen, C. J. Differential movements of VE-cadherin and PECAM-1 during transmigration of polymorphonuclear leukocytes through human umbilical vein endothelium. Blood. 100, 3597-3603 (2002).
  16. Paulsson, J. M., Jacobson, S. H., Lundahl, J. Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model. J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).
  17. Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium. Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).

Tags

Endothelial Cell-cell JunctionsNeutrophil TransmigrationPhysiological FlowLeukocyte Transendothelial MigrationParacellular RouteTranscellular RouteVE-cadherinPECAM-1In Vitro AssayFluorescent AntibodiesElectrical Cell-substrate Impedance SensingFRAP Measurements

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kroon, J., Daniel, A. E., Hoogenboezem, M., van Buul, J. D. Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow. J. Vis. Exp. (90), e51766, doi:10.3791/51766 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image