הדמיה בזמן אמת של תאי תאי צומת האנדותל במהלך נויטרופילים גלגול תחת פיזיולוגית זרימה
Summary
כדוריות דם לבנות לחצות את monolayer אנדותל באמצעות paracellular או מסלול transcellular. פיתחנו assay פשוט כדי לעקוב אחר חלוקת junctional אנדוגני VE-cadherin וPECAM-1 במהלך נדידת transendothelial יקוציט תחת זרימה פיזיולוגית להפלות בין שני מסלולי הגלגול.
Abstract
במהלך דלקת, כדוריות דם לבנות לעזוב את מחזור הדם ולחצות את האנדותל להילחם פולש פתוגנים ברקמות בסיסיים. תהליך זה ידוע כהגירת transendothelial יקוציט. שני מסלולים לויקוציטים לחצות את monolayer אנדותל תוארו: מסלול paracellular, כלומר, באמצעות תאי תאי צמתים ומסלול transcellular, כלומר, דרך גוף התא האנדותל. עם זאת, זה כבר קשה מבחינה טכנית להפלות בין הטפילים ומסלול transcellular. פיתחנו assay במבחנה פשוט ללמוד חלוקת אנדוגני VE-cadherin וPECAM-1 במהלך נדידת transendothelial נויטרופילים תחת תנאי זרימה פיסיולוגיים. לפני זלוף נויטרופילים, טופלו תאי האנדותל קצר עם נוגדני fluorescently שכותרתו נגד VE-cadherin וPECAM-1. נוגדנים אלה לא מפריעים לתפקוד של שני החלבונים, כפי שנקבע על ידי תא substra החשמלימדידות חישת עכבת te וFRAP. שימוש assay זה, היינו מסוגל לבצע את חלוקת אנדוגני VE-cadherin וPECAM-1 במהלך נדידת transendothelial תחת תנאי זרימה ולהיפלות בין מסלולי טפילים וההגירה transcellular של לויקוציטים פני האנדותל.
Introduction
הגירת transendothelial יקוציט יעילה ופיקוח הדוק (TEM) היא בעל חשיבות מרכזית בתהליכים פיסיולוגיים כגון מעקב חיסוני ודלקת חריפה. עם זאת, בתנאים פיתו-פיסיולוגי מסוימים, TEM מבוקר והמוגזם הוא ציין וכתוצאה מהמחלות כרוניות דלקתיות (למשל, דלקת מפרקים שגרונית, טרשת עורקים, אסטמה). כמו כן, במהלך גרורות של תאי גידול, התהליך של הגירת transendothelial הוא סייע לתאים סרטניים לעזוב את זרימת הדם לגרורות 1-3. על מנת במיוחד כדי להפריע ליקוציט מוגזם או TEM תאים סרטניים, נדרשת הבנה מפורטת של הרגולציה של תהליך זה.
הוא האמין כי תהליך TEM מתרחש דרך שלבים שונים. מחקרי זרע, בביקורת לפני שני עשורים על ידי הקצב ושפרינגר, הובילו למודל הרב שלבי המתאר את התהליך של TEM 4,5. מודל זה עדיין נכון, למרות שחלקם המודעהצעדי ditional נכללו 6. אלון et al. תאר את הצורך בנוכחות של כמוקינים משותקים על פני השטח של האנדותל 7. לאחרונה, הם הראו כי האנדותל עצמו מייצר כמוקינים המוצגים במשטח פסגת אנדותל 8. יתר על כן, אותה הקבוצה הציגה את החשיבות של תנאי זרימה במהלך 7 TEM. לאחרונה, מספר פרסומים התמקדו בשתי כדוריות הדם לבנות מסלולים שונים יכולים לקחת בשלב diapedesis הסופי של TEM. הם יכולים לעבור את תאי תאי צמתים, כלומר, מסלול נדידת paracellular, או לעבור בגוף התא האנדותל, הידוע במסלול נדידת transcellular 9. קרמן ועמיתיו חקרו מסלולים אלה בפירוט והגיעו למסקנה כי לויקוציטים מעדיפים לבחור את מסלול נדידת paracellular (90%) על פני מסלול transcellular (10%) בעת חציית monolayer אנדותל וריד טבור 10.עם זאת, כאשר תאי אנדותל ממקורות אחרים שמשו, למשל, מוח או microvasculature, יותר לויקוציטים משמש מסלול transcellular (30%) 11. קבוצת Vestweber לאחרונה הראתה שכאשר תאי תאי צמתים לא הצליחו לנתק את זה מזה באמצעות דפיקה-במודל חיה, החלפת אנדוגני VE-cadherin לVE-cadherin-alpha-catenin כימרה, TEM יקוציט נחסם 12 באופן מלא . באופן מפתיע, החוקרים שמו לב שTEM נחסם בכמה, אבל לא כולם, רקמות. בסך הכל, ניסויים האלגנטיים אלה הצביעו על כך שכדוריות דם לבנות העדיפו את מסלול paracellular על ציר transcellular, למרות אותות הרגולציה שמפעילים החלטה זו עדיין אינם ידועים.
למרות שהרוב המכריע של לויקוציטים מעדיף מסלול נדידת paracellular, זה עדיין קשה להבחין בין שני המסלולים. בנוסף לכך, למרות מספר מחקרים המתמקדים בתפקידו של junct תאי תאי אנדותליונים, הדינמיקה של צמתים אלה, בפרט חלבוני junctional VE-cadherin וPECAM-1, במהלך המעבר ליקוציט עדיין בדיון. פיתחנו assay פשוט יחסית שבו ניתן לנטר מולקולות הצומת האלה בזמן אמת במהלך diapedesis יקוציט תחת תנאי זרימה פיסיולוגיים באמצעות נוגדני fluorescently שכותרתו. נוגדנים אלה לא להפריע או לחסום שלמות או ניידות junctional של החלבונים הממוקדים. assay זה מאפשר לנו לעקוב אחר הדינמיקה של חלבוני junctional במהלך התהליך של TEM paracellular. בנוסף, assay זה גם מאפשר להפלות בין מסלולי נדידת הטפילים וtranscellular.
Protocol
Representative Results
Discussion
לפרוטוקול זה, זה הוא קריטי כדי למנוע ההיווצרות של בועות אוויר בזרימת התאים, שכן זה יגרום לאפופטוזיס התא וmonolayer שיבש. כדי להימנע מכך, ברצוננו להדגיש לשלם ריבית מסוימת לצעדים 4.2 ו4.5, שבו הצינורות מחוברים לזרימה קאמרית. עוד צעד קריטי בפרוטוקול הוא תחול של PMNs שנשמרים ב RT על ידי דוגריהם ל15-30 דקות ב37 מעלות צלזיוס לפני הזרקה אותם לזרימה קאמרית (שלב 4.1). כתוצאה מכך תחול של integrins יקוציט, המאפשרת להם להיצמד למולקולות דבקות כגון ICAM-1 או VCAM-1 בהאנדותל.
פרוטוקול זה אינו מוגבל ללמוד את הגלגול של נויטרופילים. ניתן להשתמש גם סוגי יקוציט אחרים כגון מונוציטים או לימפוציטים. שים לב השלב ש4.1, כלומר, תחול לויקוציטים עשוי להיות שונה בין סוגי יקוציט. כמו כן, ניתן להשתמש בסוגים אחרים של תאי האנדותל. לשם כך הוא נשאר קריטיכדי לעורר את תאי האנדותל עם גירויים דלקתיים מתאימים כגון TNF-α או IL-1β. אם נויטרופילים לא מגיבים בtransmigrating, ניתן לשקול טיפול לזמן קצר נויטרופילים (5 דק ') עם פפטיד N-formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-פנילאלנין (fMLP) 16. זה יעודדו את הנויטרופילים, בintegrins בפרט, עוד יותר, מה שהופך אותם יותר נוטה לדבוק לאנדותל.
בדרך כלל 2 מהירות זרימת סנטימטר / DYN 1 משמשת. מהירות זרימה זו נמדדת בvenules פוסט נימים, אתרים שבם רוב הגירת transendothelial יקוציט מתרחשת 17. שימוש בזרימת התאים שתוארו, ניתן להגביר את מהירות עד לזרימת 10 DYN / 2 סנטימטר. עם זאת, זה לא מומלץ להגדיל את הגזירה נוספת. זה עלול לגרום לדליפה לא רצויה של הצינור והניתוק של התאים מהזרימה קאמרית.
התוצאות מתוארות באיור 3 עולות כי אלהנוגדנים יכולים לשמש כדי לחזות וללמוד את הדינמיקה של תאי תאי צמתים האנדותל במהלך diapedesis יקוציט. בפרט, בנוסף למבחני גלגול הקיימים פרוטוקול זה מאפשר להפלות paracellular מהגירת transcellular תחת תנאי זרימה פיסיולוגיים בזמן אמת. מאז הנוגדנים להכתים את תאי תאי צמתים, אחד יכול להבקיע מספר כדוריות הדם לבנות החוצים VE-cadherin / צמתים PECAM-1-חיוביים לעומת nonpositive VE-cadherin / PECAM-1 אתרים. דרך, הגירת transcellular זה יכול להיות מופלה מהגירת paracellular.
חשוב להדגיש כי נוגדנים אלה לא מפריעים לתפקוד של החלבונים שהם נקשרים ל: הנוגדן PECAM-1 שימש במחקר זה מופנה כנגד תחום תאי השני. תאי האנדותל שהיו מצופים בנוכחות הנוגדנים לא הראו פגמים בהפצת או להרכיב monolayer, דבר המצביעים על כך שהנוגדן לפחות לאלהפריע לאינטראקציות homotypic בין תאי האנדותל. בנוסף לכך, שני הנוגדנים אינם פוגעים ביכולתם של נויטרופילים לנדוד דרך monolayer אנדותל. בנוסף, מספר הנויטרופילים שמתגלגלים לאורך monolayer אנדותל בהעדר או הנוכחות של הנוגדנים לא שינה (מידע לא מוצג). חשוב לציין, מיקרוסקופיה סריקת לייזר confocal נותנת לנו את האפשרות להקליט את ערוצי ניאון שונים ודסק"ש בו זמנית.
לפיכך, assay זה מאפשר ללמוד את הדינמיקה של VE-cadherin וPECAM-1 באותו הזמן שבו נויטרופילים חוצים את צומת תאי תאי אנדותל ויעזרו להבין מדוע לויקוציטים לבחור מסלול אחד על פנים השני, כלומר, paracellular לעומת transcellular.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | |
| μ-Slide VI | IBIDI | 80606 | Flow-chamber | |
| 0.45 μm filter | Whatman/GE Lifesciences | 10462100 | ||
| 1 mL syringe | BD Plastipak | 300013 | ||
| 20 mL syringe | BD Discardit II | 366296 | ||
| 21G needle | BD Microlance | 301155 | ||
| Albumin | Sanquin | 15522644 | ||
| Ammunium chloride (NH4Cl) | Merck | 1009245000 | ||
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 449709 | ||
| EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors | Lonza | CC-3156 + CC-4176 | media | |
| EDTA (Titriplex III) | Merck | 1370041000 | ||
| Falcon tubes | Corning Life Sciences | 352096 | ||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-2MG | FN | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ||
| In-line Luer Injection port | IBIDI | 10820 | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Merck | 105886 | ||
| PECAM-1-ALEXA-647 | BD Pharmingen | 561654 | clone WM59 stock concentration 0.1mg/mL |
|
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-09 | ||
| Phosphate Buffered Saline | Fresenius Kabi Nederland | M090001/01NL | PBS | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | ||
| Potassium hydrogen carbonate (KHCO3) | Merck | 1048540500 | ||
| Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | ||
| Silicone Tygon 3350 tubing | VWR | 228-4331 | tubing | |
| Sodium chloride (NaCl) | Calbiochem (Millipore) | 567441 | ||
| Syringe pump | Harvard Apparatus | model number 55-5920 | ||
| TNFα | Peprotech | 300-01A | tumor necrosis factor | |
| trisodium citrate | Merck | 1.06447.5000 | TNC | |
| Vacuettes | Greiner, Germany | 980044 | ||
| VE-Cadherin-FITC | BD Pharmingen | 560411 | clone 55-7H1 | stock concentration 0.5mg/mL |
| Zeiss LSM510 META | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany | |||
| Zen Software 2008 | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany |
References
- Ross, R. Atherosclerosis–an inflammatory disease. N. Engl. J. Med. 340, 115-126 (1999).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).
- Szekanecz, Z., Koch, A. E. Vascular involvement in rheumatic diseases: ‘ vascular rheumatology. Arthritis Res. Ther. 10, 224 (2008).
- Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67, 1033-1036 (1991).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76, 301-314 (1994).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Cinamon, G., Shinder, V., Shamri, R., Alon, R. Chemoattractant signals and beta 2 integrin occupancy at apical endothelial contacts combine with shear stress signals to promote transendothelial neutrophil migration. J. Immunol. 173, 7282-7291 (2004).
- Shulman, Z., Cohen, S. J., Roediger, B., et al. Transendothelial migration of lymphocytes mediated by intraendothelial vesicle stores rather than by extracellular chemokine depots. Nat. Immunol. 13, 67-76 (2012).
- Carman, C. V., Springer, T. A. Trans-cellular migration: cell-cell contacts get intimate. Curr. Opin. Cell Biol. 20, 533-540 (2008).
- Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J. Cell Biol. 167, 377-388 (2004).
- Millan, J., Hewlett, L., Glyn, M., et al. Lymphocyte transcellular migration occurs through recruitment of endothelial ICAM-1 to caveola- and F-actin-rich domains. Nat. Cell Biol. 8, 113-123 (2006).
- Schulte, D., Kuppers, V., Dartsch, N., et al. Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability. EMBO J. 30, 4157-4170 (2011).
- Buul, J. D., Mul, F. P., van der Schoot, C. E., Hordijk, P. L. ICAM-3 activation modulates cell-cell contacts of human bone marrow endothelial cells. J. Vasc. Res. 41, 28-37 (2004).
- Shaw, S. K., Bamba, P. S., Perkins, B. N., Luscinskas, F. W. Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium. J. Immunol. 167, 2323-2330 (2001).
- Su, W. H., Chen, H., Jen, C. J. Differential movements of VE-cadherin and PECAM-1 during transmigration of polymorphonuclear leukocytes through human umbilical vein endothelium. Blood. 100, 3597-3603 (2002).
- Paulsson, J. M., Jacobson, S. H., Lundahl, J. Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model. J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).
- Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium. Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).
