التصوير في الوقت الحقيقي من غشائي المفارق خلايا العدلات خلية أثناء التهجير تحت الفسيولوجية تدفق
Summary
الكريات البيض تعبر أحادي الطبقة البطانية باستخدام paracellular أو الطريق العابر للخلايا. وضعنا مقايسة بسيطة لمتابعة توزيع موصلي الذاتية VE كادهيرين وPECAM-1 خلال الكريات البيض transendothelial الهجرة تحت تدفق الفسيولوجية للتمييز بين طرق التهجير اثنين.
Abstract
أثناء الالتهاب، الكريات البيض تترك الدورة الدموية وتعبر البطانة لمكافحة غزو مسببات الأمراض في الأنسجة الكامنة. وتعرف هذه العملية باسم هجرة الكريات البيض transendothelial. وقد وصفت طريقين عن الكريات البيض لعبور أحادي الطبقة البطانية: الطريق paracellular، أي من خلال تقاطعات خلية خلية والطريق العابر للخلايا، أي من خلال جسم الخلية البطانية. ومع ذلك، فقد كان من الصعب من الناحية الفنية على التمييز بين بارا والطريق العابر للخلايا. وضعنا مقايسة بسيطة في المختبر لدراسة توزيع الذاتية VE كادهيرين وPECAM-1 خلال العدلات transendothelial الهجرة في ظل ظروف تدفق الفسيولوجية. قبل العدلات نضح، تم علاج الخلايا البطانية لفترة وجيزة مع الأجسام المضادة fluorescently المسمى ضد VE كادهيرين وPECAM-1. لم هذه الأجسام المضادة لا تتداخل مع وظيفة كل من البروتينات، كما يحددها الكهربائية خلية substraالشركة المصرية للاتصالات مقاومة الاستشعار عن بعد وFRAP القياسات. باستخدام هذا الاختبار، تمكنا من متابعة توزيع الذاتية VE كادهيرين وPECAM-1 أثناء الترحيل transendothelial تحت ظروف التدفق ويميز بين الطرق بارا والهجرة العابر للخلايا من الكريات البيض في البطانة.
Introduction
كفاءة ورقابة مشددة هجرة الكريات البيض transendothelial (TEM) ذات أهمية رئيسية في العمليات الفيزيولوجية مثل المراقبة المناعة والتهاب حاد. ومع ذلك، تحت بعض الظروف الفسيولوجية patho، TEM غير المنضبط والمفرط لوحظ الناتجة في الأمراض الالتهابية المزمنة (مثل التهاب المفاصل وتصلب الشرايين والربو). أيضا خلال الانبثاث ورم الخلايا، وعملية الهجرة transendothelial هي مفيدة لخلايا الورم لمغادرة تعميمها على metastasize 1-3. من أجل التدخل على وجه التحديد مع الكريات البيض المفرطة أو TEM الخلايا السرطانية، لا بد من فهم مفصل لتنظيم هذه العملية.
ويعتقد أن عملية TEM تحدث من خلال الخطوات المختلفة. دراسات المنوية، استعرض قبل عقدين من الزمن من قبل جزار والوثاب، أدى إلى نموذج متعددة الخطوات واصفا عملية TEM 4،5. هذا النموذج لا يزال صحيحا، رغم أن بعض الإعلاناتوقد شملت الخطوات المشروط 6. ألون وآخرون وصفت الحاجة إلى وجود كيموكينات يجمد على سطح البطانة 7. مؤخرا، أنها أظهرت أن البطانة نفسها تولد كيموكينات التي يتم تقديمها في السطح القمي البطانية 8. وعلاوة على ذلك، وضعت الجماعة نفسها إلى الأمام أهمية ظروف تدفق خلال TEM 7. مؤخرا، يمكن أن العديد من المنشورات ركزت على طريقين الكريات البيض مختلفة تأخذ في المرحلة النهائية من انسلال TEM. إما أنها يمكن أن تذهب من خلال تقاطعات خلية خلية، أي طريق الهجرة paracellular، أو عبور من خلال جسم الخلية البطانية، والمعروفة باسم العابر للخلايا طريق الهجرة 9. درس كارمان وزملاؤه هذه المسارات بالتفصيل وخلص إلى أن الكريات البيض تفضيلي اختيار طريق الهجرة paracellular (90٪) عبر الطريق العابر للخلايا (10٪) عند عبور الوريد السري البطانية أحادي الطبقة 10.ومع ذلك، عندما استخدمت الخلايا البطانية من أصول أخرى مثل المخ أو الأوعية الدموية الدقيقة، وتستخدم المزيد من الكريات البيض الطريق العابر للخلايا (30٪) 11. أظهرت مجموعة Vestweber مؤخرا أنه عندما كانت غير قادرة على فصل عن بعضها البعض باستخدام طرق في نموذج حيواني، لتحل محل الذاتية تقاطعات خلية خلية VE كادهيرين لVE كادهيرين ألفا catenin الوهم، تم حجب الكريات البيض TEM بالكامل 12 . والمثير للدهشة، لاحظ المؤلفون أن TEM تم حجب في العديد، ولكن ليس كل شيء، والأنسجة. عموما، أشارت هذه التجارب الأنيقة التي الكريات البيض فضل الطريق paracellular على الطريق العابر للخلايا، على الرغم من الإشارات التنظيمية التي تؤدي هذا القرار لا تزال غير معروفة.
على الرغم من أن الغالبية العظمى من الكريات البيض يفضلون طريق الهجرة paracellular، فإنه لا يزال من الصعب التمييز بين كل من المسارات. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من العديد من الدراسات التي تركز على دور البطانية junct خلية خليةالأيونات، وديناميات هذه التقاطعات، ولا سيما البروتينات صلي VE كادهيرين وPECAM-1، خلال معبر الكريات البيض لا يزال قيد النقاش. وضعنا مقايسة بسيطة نسبيا والتي تقاطع هذه الجزيئات يمكن رصدها في الوقت الحقيقي خلال انسلال الكريات البيض تحت ظروف تدفق الفسيولوجية باستخدام الأجسام المضادة fluorescently المسمى. لم هذه الأجسام المضادة لا يتداخل أو عرقلة سلامة صلي أو التنقل من البروتينات المستهدفة. هذا الاختبار يسمح لنا لمتابعة ديناميكية البروتينات صلي أثناء عملية paracellular TEM. بالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا الاختبار أيضا تمييزا بين طرق الهجرة شبه النظامية والعابر للخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
لهذا البروتوكول، فمن الأهمية بمكان لمنع تشكيل فقاعات الهواء في التدفق من الدوائر، لأن هذا سوف يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج الخلية وأحادي الطبقة تعطلت. لتجنب هذا، نود أن نؤكد لدفع فوائد خاصة الخطوات 4.2 و 4.5، حيث يتم توصيل الأنابيب إلى غرفة التدفق. آخر خطوة حاسمة في البروتوكول هي فتيلة من PMNs التي يتم الاحتفاظ بها في RT التي تفرخ لهم ل15-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل حقنها إلى تدفق غرفة (الخطوة 4.1). هذه النتائج في فتيلة من integrins الكريات البيض، مما يتيح لهم الانضمام إلى جزيئات الالتصاق مثل ICAM-1 أو VCAM-1 في البطانة.
لا يقتصر هذا البروتوكول لدراسة التهجير من العدلات. أيضا أنواع أخرى مثل الكريات البيض وحيدات الخلايا اللمفية أو يمكن استخدام. لاحظ أن الخطوة 4.1، أي فتيلة الكريات البيض قد تختلف بين أنواع الكريات البيض. أيضا، وأنواع أخرى من الخلايا البطانية يمكن استخدامها. لهذا فإنها لا تزال حرجةلتحفيز الخلايا البطانية مع المحفزات المناسبة التهابات مثل TNF-α أو IL-1β. إذا العدلات لا تستجيب في transmigrating، يمكن للمرء النظر علاج لفترة وجيزة العدلات (5 دقائق) مع N-فورميل-L-methionyl-L-لوسيل-L-فينيل ألانين (fMLP) الببتيد 16. وهذا تحفيز العدلات، ولا سيما integrins، وأبعد من ذلك، مما يجعلها أكثر عرضة للالتمسك البطانة.
وعادة ما تستخدم 1 داين / سم 2 سرعة التدفق. يتم قياس هذه السرعة في تدفق الأوردة بعد الشعرية، المواقع التي يحدث فيها معظم هجرة الكريات البيض transendothelial 17. استخدام وصف تدفق غرف، فمن الممكن زيادة سرعة تدفق تصل إلى 10 داين / سم 2. ومع ذلك، فمن غير المستحسن لزيادة القص أبعد من ذلك. فإنه قد يؤدي إلى تسرب غير مرغوب فيه من الأنابيب ومفرزة من الخلايا الموجهة من غرفة التدفق.
نتائج موضح في الشكل (3) تدل على أن هذهالأجسام المضادة يمكن استخدامها لتصور ودراسة ديناميات البطانية تقاطعات خلية خلية خلال انسلال الكريات البيض. على وجه الخصوص، بالإضافة إلى فحوصات التهجير القائمة هذا البروتوكول يسمح للتمييز paracellular من الهجرة العابر للخلايا في ظل الظروف الفسيولوجية تدفق في الوقت الحقيقي. منذ الأجسام المضادة وصمة عار على تقاطعات خلية خلية، يمكن للمرء أن يسجل عدد الكريات البيض التي تعبر VE كادهيرين / تقاطعات PECAM-1-الإيجابية مقابل nonpositive-VE كادهيرين / PECAM-1 المواقع. بهذه الطريقة، والهجرة العابر للخلايا يمكن تمييز من الهجرة paracellular.
من المهم التأكيد على أن هذه الأجسام المضادة لا تتداخل مع وظيفة من البروتينات التي تربط ل: الأجسام المضادة PECAM-1 المستخدمة في هذه الدراسة موجهة ضد المجال خارج الخلية الثانية. الخلايا البطانية التي كانت مطلية في وجود الأجسام المضادة لم تظهر أي عيوب في نشر أو تشكيل أحادي الطبقة، مما يشير إلى أن الجسم المضاد لم يقل لاتتداخل مع التفاعلات بين الخلايا البطانية مثلي النمط. بالإضافة إلى ذلك، كل من الأجسام المضادة لا يضعف قدرة العدلات على الهجرة من خلال أحادي الطبقة البطانية. بالإضافة إلى ذلك، لا يتم تغيير عدد العدلات أن transmigrate عبر أحادي الطبقة البطانية في غياب أو وجود الأجسام المضادة (لا تظهر البيانات). الأهم من ذلك، متحد البؤر المسح المجهري بالليزر يعطي لنا إمكانية لتسجيل القنوات الفلورسنت مختلفة ومدينة دبي للإنترنت في وقت واحد.
وبالتالي، يسمح هذا الاختبار دراسة ديناميات-VE كادهيرين وPECAM-1 في نفس الوقت عندما تعبر على العدلات والبطانية تقاطع خلية خلية، وسوف تساعد على فهم لماذا الكريات البيض اختيار طريق واحد على الآخر، أي paracellular مقابل العابر للخلايا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | |
| μ-Slide VI | IBIDI | 80606 | Flow-chamber | |
| 0.45 μm filter | Whatman/GE Lifesciences | 10462100 | ||
| 1 mL syringe | BD Plastipak | 300013 | ||
| 20 mL syringe | BD Discardit II | 366296 | ||
| 21G needle | BD Microlance | 301155 | ||
| Albumin | Sanquin | 15522644 | ||
| Ammunium chloride (NH4Cl) | Merck | 1009245000 | ||
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 449709 | ||
| EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors | Lonza | CC-3156 + CC-4176 | media | |
| EDTA (Titriplex III) | Merck | 1370041000 | ||
| Falcon tubes | Corning Life Sciences | 352096 | ||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-2MG | FN | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ||
| In-line Luer Injection port | IBIDI | 10820 | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Merck | 105886 | ||
| PECAM-1-ALEXA-647 | BD Pharmingen | 561654 | clone WM59 stock concentration 0.1mg/mL |
|
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-09 | ||
| Phosphate Buffered Saline | Fresenius Kabi Nederland | M090001/01NL | PBS | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | ||
| Potassium hydrogen carbonate (KHCO3) | Merck | 1048540500 | ||
| Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | ||
| Silicone Tygon 3350 tubing | VWR | 228-4331 | tubing | |
| Sodium chloride (NaCl) | Calbiochem (Millipore) | 567441 | ||
| Syringe pump | Harvard Apparatus | model number 55-5920 | ||
| TNFα | Peprotech | 300-01A | tumor necrosis factor | |
| trisodium citrate | Merck | 1.06447.5000 | TNC | |
| Vacuettes | Greiner, Germany | 980044 | ||
| VE-Cadherin-FITC | BD Pharmingen | 560411 | clone 55-7H1 | stock concentration 0.5mg/mL |
| Zeiss LSM510 META | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany | |||
| Zen Software 2008 | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany |
References
- Ross, R. Atherosclerosis–an inflammatory disease. N. Engl. J. Med. 340, 115-126 (1999).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).
- Szekanecz, Z., Koch, A. E. Vascular involvement in rheumatic diseases: ‘ vascular rheumatology. Arthritis Res. Ther. 10, 224 (2008).
- Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67, 1033-1036 (1991).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76, 301-314 (1994).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Cinamon, G., Shinder, V., Shamri, R., Alon, R. Chemoattractant signals and beta 2 integrin occupancy at apical endothelial contacts combine with shear stress signals to promote transendothelial neutrophil migration. J. Immunol. 173, 7282-7291 (2004).
- Shulman, Z., Cohen, S. J., Roediger, B., et al. Transendothelial migration of lymphocytes mediated by intraendothelial vesicle stores rather than by extracellular chemokine depots. Nat. Immunol. 13, 67-76 (2012).
- Carman, C. V., Springer, T. A. Trans-cellular migration: cell-cell contacts get intimate. Curr. Opin. Cell Biol. 20, 533-540 (2008).
- Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J. Cell Biol. 167, 377-388 (2004).
- Millan, J., Hewlett, L., Glyn, M., et al. Lymphocyte transcellular migration occurs through recruitment of endothelial ICAM-1 to caveola- and F-actin-rich domains. Nat. Cell Biol. 8, 113-123 (2006).
- Schulte, D., Kuppers, V., Dartsch, N., et al. Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability. EMBO J. 30, 4157-4170 (2011).
- Buul, J. D., Mul, F. P., van der Schoot, C. E., Hordijk, P. L. ICAM-3 activation modulates cell-cell contacts of human bone marrow endothelial cells. J. Vasc. Res. 41, 28-37 (2004).
- Shaw, S. K., Bamba, P. S., Perkins, B. N., Luscinskas, F. W. Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium. J. Immunol. 167, 2323-2330 (2001).
- Su, W. H., Chen, H., Jen, C. J. Differential movements of VE-cadherin and PECAM-1 during transmigration of polymorphonuclear leukocytes through human umbilical vein endothelium. Blood. 100, 3597-3603 (2002).
- Paulsson, J. M., Jacobson, S. H., Lundahl, J. Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model. J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).
- Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium. Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).
