В режиме реального времени изображений эндотелиальных межклеточных соединений Во нейтрофилов Трансмиграция в физиологических Flow
Summary
Лейкоциты пересечь эндотелия монослоя с помощью парацеллюлярная или трансцеллюлярного маршрут. Мы разработали простой анализ следовать распределение эндогенного Junctional VE-кадгерин и PECAM-1 во лейкоцитов трансэндотелиальной миграции в физиологических потока различать между двумя переселении маршрутов.
Abstract
Во время воспаления, лейкоциты покинуть кровообращение и пересечь эндотелий бороться вторжения патогенов в подлежащие ткани. Этот процесс известен как лейкоцитов трансэндотелиальной миграции. Две трассы для лейкоцитов пересечь эндотелия монослоя были описаны: в парацеллюлярного маршрут, т.е. через межклеточных соединений и трансцеллюлярного маршруту, то есть, через эндотелия тела клетки. Тем не менее, это было технически трудно различить пара- и трансцеллюлярного маршрута. Мы разработали простой анализ в пробирке, чтобы изучить распределение эндогенных VE-кадгерин и PECAM-1 во время нейтрофилов трансэндотелиальной миграции в физиологических условиях потока. До нейтрофилов перфузии, эндотелиальные клетки были кратко обрабатывали флуоресцентно-меченых антител против VE-кадгерина и PECAM-1. Эти антитела не мешают функции обоих белков, как было определено с помощью электрического клеток-substraИзмерения те сопротивление зондирования и FRAP. С помощью этого анализа, мы были в состоянии следовать распределение эндогенных VE-кадгерин и PECAM-1 во время трансэндотелиальной миграции в условиях кровотока и различать параметрами и трансцеллюлярного путей миграции лейкоцитов через эндотелий.
Introduction
Эффективное и жестко контролируется лейкоцитов трансэндотелиальный миграции (TEM) имеет ключевое значение в физиологических процессах, таких как иммунного надзора и острого воспаления. Тем не менее, при определенных патофизиологических условиях, неконтролируемое и чрезмерное ТЕМ наблюдаемую в результате хронических воспалительных заболеваний (например, ревматоидный артрит, атеросклероз, астма). Также в течение метастазов опухолевых клеток, процесс миграции трансэндотелиальной играет важную роль в опухолевые клетки, чтобы оставить циркуляцию к метастазированию 1-3. Для того, чтобы специально мешать чрезмерного лейкоцитов или опухолевых клеток ТЭМ, детальное понимание регуляции этого процесса требуется.
Считается, что этот процесс происходит через ТЭМ различных этапов. Семенные исследования, оцененные два десятилетия назад Мясник и Springer, привело к многоступенчатой модели, описывающей процесс ТЕА 4,5. Эта модель все еще сохраняется, хотя некоторые объявлениянительные шаги были включены 6. Алон и соавт. Описал потребность в присутствии иммобилизованных хемокинов на поверхности эндотелия 7. В последнее время они показали, что сам эндотелий вырабатывает хемокинов, которые представлены на эндотелиальной апикальной поверхности 8. Более того, та же группа выдвинула важность условий потока во время ТЭМ 7. В последнее время несколько публикаций были посвящены двум различным маршрутам лейкоцитов может принять на заключительном этапе диапедез ТЕА. Они могут либо пройти межклеточных соединений, то есть, в парацеллюлярная миграционный путь, или пересекают эндотелия тела клетки, известный как трансцеллюлярного маршрута миграции 9. Карман и его коллеги изучили эти пути в деталях и пришли к выводу, что лейкоциты преимущественно выбрать парацеллюлярная миграционный путь (90%) по сравнению с трансцеллюлярного маршруту (10%) при пересечении пупочной вены эндотелия монослой 10.Однако, когда были использованы эндотелиальные клетки из других источников, например, головного мозга или микрососудов, больше лейкоцитов использовали трансцеллюлярного маршрут (30%) 11. Группа Vestweber недавно показали, что, когда межклеточных соединений были не в состоянии отделить друг от друга с помощью домино в животной модели, замены эндогенного VE-кадгерин для VE-кадгерин-альфа-катенина химерой, лейкоцитов ТЕМ был полностью заблокирован 12 . Удивительно, но авторы заметили, что ПЭМ был заблокирован в нескольких, но не всех, ткани. В целом, эти элегантные эксперименты показали, что лейкоциты предпочли парацеллюлярного маршрут над трансцеллюлярного маршруту, хотя регуляторные сигналы, которые вызывают это решение до сих пор неизвестны.
Несмотря на то, что большинство лейкоцитов предпочитают парацеллюлярная маршрут перемещения, оно по-прежнему трудно различить обоих путей. Кроме того, несмотря на несколько исследований, посвященных роли эндотелиальной турным межклеточнойионы, динамика этих переходов, в частности соединительных белков VE-кадгерин и PECAM-1, во время лейкоцитов пересечения до сих пор обсуждается. Мы разработали сравнительно простой тест, в котором эти молекулы распределительные можно контролировать в режиме реального времени во время лейкоцитов диапедез в физиологических условиях потока с использованием флуоресцентно-меченых антител. Эти антитела не вмешиваться или блокировать Junctional целостность или подвижность целевых белков. Этот анализ позволяет проследить динамику соединительных белков в процессе парацеллюлярной ТЭМ. Кроме того, этот анализ также позволяет дискриминацию между параметрами и трансцеллюлярного миграционных путей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для этого протокола, она имеет решающее значение для предотвращения образования воздушных пузырьков в потоке-камер, так как это приведет к клеточной апоптоза и нарушенного монослоя. Чтобы избежать этого, мы хотели бы подчеркнуть, обратить особое интерес к шагов 4,2 и 4,5, где трубы, подключенных к оттоку камеры. Другим важным шагом в протоколе является грунтовка из PMNs, которые хранятся при комнатной температуре путем инкубации их в течение 15-30 мин при 37 ° С до инъекционных их с блок-камеры (шаг 4.1). Это приводит к грунтовки лейкоцитов интегринов, что позволяет им придерживаться молекул адгезии, таких как ICAM-1 или VCAM-1 в эндотелии.
Этот протокол не ограничивается, чтобы изучить трансмиграцию нейтрофилов. Также могут быть использованы другие типы лейкоцитов, таких как моноциты или лимфоцитов. Отметим, что шаг 4,1, то есть, грунтования лейкоциты могут отличаться между типами лейкоцитов. Кроме того, другие типы эндотелиальных клеток могут быть использованы. Для этого остается критическимстимулировать эндотелиальные клетки с соответствующими воспалительных стимулов, таких как TNF-α или IL-1β. Если нейтрофилы не реагируют на переходим, можно считать обработку кратко нейтрофилов (5 мин) с N-формил-L-метионил-L-лейцил-L-фенилаланин (FMLP) пептида 16. Это будет стимулировать нейтрофилы, в частности их интегринов, еще дальше, делая их более склонными придерживаться эндотелия.
Обычно используется 1 дин / см скорость потока 2. Эта скорость потока измеряется в посткапиллярных венул, сайтов, где большая часть миграции лейкоцитов трансэндотелиальный происходит 17. Используя описанные потока-камер, можно увеличить скорость потока до 10 дин / см 2. Тем не менее, это не рекомендуется, чтобы увеличить сдвига дальше. Это может привести к нежелательной утечки трубопровода и отрыва клеток из потока-камеры.
Результаты, описанные на рисунке 3, показывают, что этиантитела могут быть использованы для визуализации и изучения динамики переходов межклеточных эндотелиальных во лейкоцитов диапедез. В частности, в дополнение к существующим Трансмиграция анализов Этот протокол позволяет различать парацеллюлярная от трансцеллюлярного миграции в физиологических условиях потока в реальном времени. Поскольку антитела окрашивают межклеточных соединений, можно забить количество лейкоцитов, что пересечь VE-кадгерина / PECAM-1-положительных переходов по сравнению с неположительны VE-кадгерина / PECAM-1-сайтов. Таким образом, трансцеллюлярного миграция может быть подвергнут дискриминации от парацеллюлярной миграции.
Важно подчеркнуть, что эти антитела не мешают функции белков они связываются с: PECAM-1 антитело, используемое в данном исследовании, направленных против второй внеклеточного домена. Эндотелиальные клетки, которые высевали в присутствии антител не было обнаружено никаких дефектов в распространении или образуя монослой, предполагая, что антитело по крайней мере, не сделалмешать однотипных взаимодействий между эндотелиальными клетками. В дополнение к этому, оба антитела не ухудшают способность нейтрофилов мигрировать через монослой эндотелиальных. Кроме того, количество нейтрофилов, что переселяться через монослой эндотелиальных в отсутствие или в присутствии антител не изменяется (данные не показаны). Важно отметить, что конфокальной лазерной сканирующей микроскопии дает нам возможность записать различные флуоресцентные каналы и DIC одновременно.
Таким образом, этот анализ позволяет изучать динамику VE-кадгерина и PECAM-1, в то же время, когда нейтрофилов пересекает эндотелия переход межклеточной и поможет понять, почему лейкоциты выбрать один маршрут над другой, т.е. парацеллюлярная против трансцеллюлярного.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | |
| μ-Slide VI | IBIDI | 80606 | Flow-chamber | |
| 0.45 μm filter | Whatman/GE Lifesciences | 10462100 | ||
| 1 mL syringe | BD Plastipak | 300013 | ||
| 20 mL syringe | BD Discardit II | 366296 | ||
| 21G needle | BD Microlance | 301155 | ||
| Albumin | Sanquin | 15522644 | ||
| Ammunium chloride (NH4Cl) | Merck | 1009245000 | ||
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 449709 | ||
| EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors | Lonza | CC-3156 + CC-4176 | media | |
| EDTA (Titriplex III) | Merck | 1370041000 | ||
| Falcon tubes | Corning Life Sciences | 352096 | ||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-2MG | FN | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ||
| In-line Luer Injection port | IBIDI | 10820 | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Merck | 105886 | ||
| PECAM-1-ALEXA-647 | BD Pharmingen | 561654 | clone WM59 stock concentration 0.1mg/mL |
|
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-09 | ||
| Phosphate Buffered Saline | Fresenius Kabi Nederland | M090001/01NL | PBS | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | ||
| Potassium hydrogen carbonate (KHCO3) | Merck | 1048540500 | ||
| Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | ||
| Silicone Tygon 3350 tubing | VWR | 228-4331 | tubing | |
| Sodium chloride (NaCl) | Calbiochem (Millipore) | 567441 | ||
| Syringe pump | Harvard Apparatus | model number 55-5920 | ||
| TNFα | Peprotech | 300-01A | tumor necrosis factor | |
| trisodium citrate | Merck | 1.06447.5000 | TNC | |
| Vacuettes | Greiner, Germany | 980044 | ||
| VE-Cadherin-FITC | BD Pharmingen | 560411 | clone 55-7H1 | stock concentration 0.5mg/mL |
| Zeiss LSM510 META | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany | |||
| Zen Software 2008 | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany |
References
- Ross, R. Atherosclerosis–an inflammatory disease. N. Engl. J. Med. 340, 115-126 (1999).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).
- Szekanecz, Z., Koch, A. E. Vascular involvement in rheumatic diseases: ‘ vascular rheumatology. Arthritis Res. Ther. 10, 224 (2008).
- Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67, 1033-1036 (1991).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76, 301-314 (1994).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Cinamon, G., Shinder, V., Shamri, R., Alon, R. Chemoattractant signals and beta 2 integrin occupancy at apical endothelial contacts combine with shear stress signals to promote transendothelial neutrophil migration. J. Immunol. 173, 7282-7291 (2004).
- Shulman, Z., Cohen, S. J., Roediger, B., et al. Transendothelial migration of lymphocytes mediated by intraendothelial vesicle stores rather than by extracellular chemokine depots. Nat. Immunol. 13, 67-76 (2012).
- Carman, C. V., Springer, T. A. Trans-cellular migration: cell-cell contacts get intimate. Curr. Opin. Cell Biol. 20, 533-540 (2008).
- Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J. Cell Biol. 167, 377-388 (2004).
- Millan, J., Hewlett, L., Glyn, M., et al. Lymphocyte transcellular migration occurs through recruitment of endothelial ICAM-1 to caveola- and F-actin-rich domains. Nat. Cell Biol. 8, 113-123 (2006).
- Schulte, D., Kuppers, V., Dartsch, N., et al. Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability. EMBO J. 30, 4157-4170 (2011).
- Buul, J. D., Mul, F. P., van der Schoot, C. E., Hordijk, P. L. ICAM-3 activation modulates cell-cell contacts of human bone marrow endothelial cells. J. Vasc. Res. 41, 28-37 (2004).
- Shaw, S. K., Bamba, P. S., Perkins, B. N., Luscinskas, F. W. Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium. J. Immunol. 167, 2323-2330 (2001).
- Su, W. H., Chen, H., Jen, C. J. Differential movements of VE-cadherin and PECAM-1 during transmigration of polymorphonuclear leukocytes through human umbilical vein endothelium. Blood. 100, 3597-3603 (2002).
- Paulsson, J. M., Jacobson, S. H., Lundahl, J. Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model. J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).
- Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium. Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).
