Regia neuroni dopaminergici differenziazione da cellule staminali pluripotenti umane

Dopaminergica (DA), i neuroni possono essere trovati in diverse regioni del cervello, tra cui il mesencefalo, l'ipotalamo, retina, e bulbi olfattivi. I neuroni A9 DA nella pars compacta della substantia nigra (SNPC) comportamento di controllo e il movimento proiettando alla striato nel proencefalo e formare il sistema motorio extrapiramidale. La degenerazione dei neuroni A9 DA conduce alla malattia di Parkinson (PD), che è la seconda malattia neurodegenerativa umana più comune e attualmente incurabile. Terapia di sostituzione cellulare è una delle strategie più promettenti per il trattamento della malattia di Parkinson ^1, quindi, c'è stato un grande interesse derivante neuroni A9 DA da cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs), includendo sia le cellule staminali embrionali umane (hESC) e il recenti cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs).

Molta ricerca ha cercato di ricavare neuroni A9 DA da hPSCs utilizzando vari metodi. Le prime relazioni di tutti i neuroni DA generati attraverso una neuralefase progenitore rosetta. In co-coltura con MS5 ² o PA6 ^3-5 cellule stromali con o senza fattori di crescita esterna per 2-4 settimane, L. Studer e colleghi e di altri tre gruppi indotte con successo hESC per produrre rosette neurali. Hanno poi arricchito queste rosette di dissezione meccanica o digestione enzimatica per un'ulteriore differenziazione. In altri rapporti, i ricercatori hanno generato rosette neurali attraverso il corpo embrioide (EB) galleggianti cultura differenziazione ^6-9. In seguito, i ricercatori hanno stabilito un monostrato basato metodo differenziazione ^10,11, dove si placcati hESC e hiPSCs sulla matrice extracellulare, aggiunti diversi fattori di crescita nella cultura di indurre la differenziazione di hPSCs di neuroni DA, che imita il vivo DA sviluppo embrionale dei neuroni in . Anche se tutti questi studi ottenuti tirosina idrossilasi (TH) cellule esprimente con alcune caratteristiche di neuroni DA, l'intero processo di differenziazione è il tempo e il lavoro consumo,generalmente inefficiente, e, soprattutto, l'identità A9 di questi neuroni non sono state dimostrate nella maggior parte degli studi, eccetto quella con Lmx1a espressione ectopica ^12. Recentemente, un piatto nuovo piano (FP) basata su protocollo è stato sviluppato ^13-16, in cui i precursori FP con DA potenziale del neurone sono stati generati dall'attivazione del riccio Sonic e canoniche vie di segnalazione Wnt durante la fase iniziale della differenziazione, e quindi queste cellule FP sono stati ulteriormente specificati per neuroni DA. Anche se questo protocollo è più efficiente, ci sono ancora alcuni problemi; per esempio, l'intero processo di differenziazione richiede molto tempo (almeno 35 giorni) ed è dipendente cella alimentatore ^15, o è dipendente EB ¹⁶ o l'identità A9 non è stato dimostrato ^14.

Qui, sulla base delle conoscenze di sviluppo embrionale in vivo DA neurone e risultati pubblicati di altri ricercatori, abbiamo ottimizzato le condizioni di coltura per l'effgenerazione icient di DA neuroni da entrambi hESC e hiPSCs. In primo luogo abbiamo generato cellule FP precursori dalla attivazione del segnale Wnt canonica con piccola molecola CHIR99021 e sonic hedgehog segnalazione con piccole molecole SAG e purmorphamine. Queste cellule esprimono FP Foxa2, Lmx1a, CORIN, OTX2 e nestina. Abbiamo poi specificato queste cellule FP a neuroni DA con fattori di crescita, tra cui BDNF, GDNF, ecc. I neuroni DA generati sono di tipo cellulare A9 come sono positivi per GIRK2 mentre negativo per calbindin ^17. Questo protocollo è cella alimentatore o EB indipendente, altamente efficiente e riproducibile. Usando questo protocollo, si può ricavare neuroni DA in meno di 4 settimane dalla hESC o hiPSCs di persone normali per lo studio trapianto di cellule, o da hiPSCs di pazienti PD per la modellazione in vitro di PD o testare potenziali agenti terapeutici per il PD.