توجه الدوبامين العصبية التمايز من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان
Summary
We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson’s disease.
Abstract
Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson’s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.
Introduction
الدوبامين (DA) الخلايا العصبية يمكن العثور عليها في عدة مناطق الدماغ، بما في ذلك المخ الأوسط، المهاد، شبكية العين، وبصيلات الشم. الخلايا العصبية A9 DA في بارس المادة السوداء المكتنزة (SNpc) سلوك السيطرة والحركة من خلال إبراز أن المخطط في الدماغ الأمامي وتشكيل الجهاز الحركي خارج الهرمي. تنكس الخلايا العصبية A9 DA يؤدي إلى مرض باركنسون (PD)، الذي هو الثاني الأكثر شيوعا اضطراب الاعصاب البشري وغير قابل للشفاء حاليا. العلاج ببدائل الخلية هي واحدة من الاستراتيجيات الواعدة لعلاج PD 1، لذلك، كان هناك اهتمام كبير في استخلاص الخلايا العصبية A9 DA من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs)، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) و خلايا الأخيرة من صنع الإنسان الجذعية المحفزة (hiPSCs).
وقد حاول الكثير من البحوث لاستخلاص الخلايا العصبية A9 DA من hPSCs باستخدام أساليب مختلفة. أقرب تقارير عن الخلايا العصبية DA المتولدة من خلال العصبيةردة مرحلة السلف. من خلال التعاون مع زراعة MS5 2 أو PA6 3-5 خلايا انسجة مع أو بدون عوامل النمو الخارجية لمدة 2-4 أسابيع، L. ستودر والزملاء وثلاث مجموعات أخرى يسببها hESCs بنجاح لإنتاج ريدات العصبية. ثم أنها المخصب هذه ريدات من قبل تشريح الميكانيكية أو الهضم الأنزيمي لمزيد من التمايز. في تقارير أخرى، ولدت الباحثون ريدات العصبية خلال الجسم مضغي الشكل (EB) العائمة ثقافة التمايز 6-9. في وقت لاحق، أنشأ الباحثون أحادي الطبقة أساس طريقة التمايز 10،11، حيث مطلي hESCs وhiPSCs على مصفوفة الخلوية الإضافية وأضاف عوامل النمو المختلفة في الثقافة للحث على تمايز الخلايا العصبية hPSCs إلى DA، الذي يحاكي في الجسم الحي DA الخلايا العصبية الجنينية تنمية . على الرغم من كل هذه الدراسات التي تم الحصول عليها هيدروكسيلاز التيروزين (TH) خلايا -expressing مع بعض خصائص الخلايا العصبية DA، عملية التمايز كلها تستهلك الوقت والعمل،غير فعالة بشكل عام، والأهم من ذلك، كانت هوية A9 من هذه الخلايا العصبية لم تظهر في معظم الدراسات باستثناء واحد مع LMX1a التعبير خارج الرحم 12. مؤخرا، تم تطوير لوحة الطابق الجديد (FP) المستندة إلى بروتوكول 13-16، والتي تم إنشاؤها السلائف FP مع DA إمكانات الخلايا العصبية لأول مرة تفعيل القنفذ سونيك والكنسي WNT مسارات الإشارات خلال المرحلة الأولى من التمايز، ومن ثم تم تحديد هذه الخلايا FP أيضا على الخلايا العصبية DA. على الرغم من هذا البروتوكول هو أكثر كفاءة، لا تزال هناك بعض المشاكل؛ على سبيل المثال، عملية التمايز كلها تستغرق وقتا طويلا (35 يوما على الأقل) هي وحدة تغذية الخلايا تعتمد 15، أو هي EB تعتمد 16 أو هوية A9 لم أظهر 14.
هنا، على أساس من المعرفة في الجسم الحي تطوير DA الخلايا العصبية الجنينية والنتائج المنشورة الباحثين الآخرين، قمنا الأمثل الظروف الثقافة لممثل المؤسسةicient جيل من الخلايا العصبية DA من كلا hESCs وhiPSCs. نحن ولدت لأول مرة خلايا FP السلائف من تفعيل الإشارات WNT الكنسي مع جزيء صغير CHIR99021 والقنفذ سونيك يشير مع جزيئات صغيرة SAG وpurmorphamine. هذه الخلايا FP تعبر FOXA2، LMX1a، CORIN، OTX2 وNESTIN. نحن ثم تحديد هذه الخلايا إلى الخلايا العصبية DA FP مع عوامل النمو بما في ذلك عامل التغذية العصبية، GDNF، الخ. الخلايا العصبية DA المولدة هي من A9 نوع من الخلايا كما هي ايجابية للGIRK2 حين سلبية للCalbindin 17. هذا البروتوكول هو الخلايا المغذية أو EB مستقلة وذات كفاءة عالية وقابلة للتكرار. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن للمرء استخلاص الخلايا العصبية DA في أقل من 4 أسابيع من hESCs أو hiPSCs من الأشخاص العادي للدراسة زرع الخلايا، أو من hiPSCs من المرضى PD لفي المختبر نمذجة PD أو اختبار العوامل العلاجية المحتملة لPD.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (بما في ذلك hESCs وhiPSCs) يمكن التفريق في المختبر لتوليد معظم، إن لم يكن كل، أنواع الخلايا من الجسم بما في ذلك الخلايا العصبية DA، الذي ثبت في الدراسات السابقة 19. هنا، على أساس المعرفة من الدوبامين العصبية الجنينية تطوير 20 و?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank members of the Renee Reijo Pera laboratory for help during development of this protocol and during preparation of this manuscript. This work is supported by California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) shared laboratory (CL-00518).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| penicillin/ampicillin | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| Non-essential amino acid | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | 17104-019 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Growth factor reduced matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R&D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-beta3 | R&D Systems | 243-B3-002 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Mouse anti human NESTIN antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | 1/1000 dilution |
| Rabbit anti human OTX2 antibody | Millipore | AB9566 | 1/2000 dilutiion |
| Goat anti human FOXA2 antibody | R&D Systems | AF2400 | 1/200 dilution |
| rabbit anti human LMX1a antibody | Millipore | AB10533 | 1/1000 dilution |
| Rabbit anti human TH antibody | Pel Freez | P40101 | 1/500 dilution |
| Chicken anti human TH antibody | Millipore | AB9702 | 1/500 dilution |
| Mouse anti human TUJ1 antibody | Covance | MMS-435P | 1/2000 dilution |
| Rabbit anti human GIRK2 antibody | Abcam | ab30738 | 1/300 dilution |
| Rabbit anti human Calbindin antibody | Abcam | ab25085 | 1/400 dilution |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 |
References
- Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).
- Park, C. H., et al. In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).
- Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells. 22, 669-674 (2004).
- Zeng, X., et al. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22, 925-940 (2004).
- Yan, Y., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
- Schulz, T. C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).
- Park, S., et al. Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors. Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).
- Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson’s disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).
- Sanchez-Danes, A., et al. Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
- Xi, J., et al. Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1, 703-714 (2012).
- Mendez, I., et al. Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson’s disease. Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Nishimura, K., Takahashi, J. Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson’s disease. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).
- Wang, G., et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).
