Режиссер дофаминергических Neuron Дифференциация от человека плюрипотентных стволовых клеток

Дофаминергический (DA) нейроны можно найти в нескольких областях мозга, в том числе среднего мозга, гипоталамуса, сетчатке и обонятельных луковиц. Нейроны A9 DA в черной субстанции Парс компактов (SNPC) поведения управления и движения, проецируя на полосатом теле в переднем мозге и формирования экстрапирамидной системы двигателя. Вырождение A9 DA нейронов приводит к болезни Паркинсона (БП), который является вторым наиболее распространенным человек нейродегенеративные расстройства и в настоящее время неизлечимыми. Замена Клеточная терапия является одним из наиболее перспективных стратегий для лечения PD ^1, поэтому, там был большой интерес при выводе A9 DA нейроны от человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs), в том числе и человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и Недавнее человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs).

Много исследований попытались вывести A9 DA нейроны от hPSCs с использованием различных методов. Самые ранние отчеты все генерируемые DA нейроны через нейроннуюрозетка этап предшественников. По совместном культивировании с MS5 ² или ПА6 ^3-5 стромальных клеток с или без внешних факторов роста в течение 2-4 недель, L. Studer и коллегами и трех других групп успешно индуцированных ЭСК, чтобы произвести нейронных розетки. Затем они обогатили эти розетки от механического вскрытия или ферментативного расщепления для дальнейшей дифференциации. В других докладах, исследователи генерируется нейронных розетки через эмбриоидов тела (EB) плавающие культуры дифференциацию ^6-9. Позже исследователи установили монослоя на основе метода дифференциации ^10,11, где они покрытием ЭСК и hiPSCs на внеклеточного матрикса, добавили различные факторы роста в культуре, чтобы вызвать дифференциацию hPSCs к DA нейронов, которая имитирует в естественных условиях развития эмбриональных DA нейронов . Хотя все эти исследования получены тирозингидроксилазу (TH) экспрессирующие клетки с некоторыми характеристиками DA нейронов, весь процесс дифференциации время и трудоемким,как правило, неэффективно, и что более важно, A9 идентичность этих нейронов не были продемонстрированы в большинстве исследований, кроме одного с LMX1a эктопической экспрессии ^12. В последнее время новый плиты перекрытия (FP) основанное был разработан протокол ^13-16, в котором предшественники FP с DA нейронов потенциала были впервые подготовлена ​​путем активации звуковой ежа и канонических Wnt сигнальных путей на ранней стадии дифференцировки, а затем эти клетки FP были дополнительно указываться в DA нейронов. Хотя этот протокол является более эффективным, все еще существуют некоторые проблемы; Например, весь процесс дифференциации занимает много времени (по крайней мере, 35 дней), и это зависит от клеток-фидеров ^15, или EB зависит ¹⁶ или личность A9 не была продемонстрирована ^14.

Здесь, на основе знаний из в естественных условиях эмбрионального развития DA нейронов и опубликованных результатов других исследователей, мы оптимизировали условий культивирования для эфпоколение циент из DA нейронов обеих ЭСК и hiPSCs. Мы сначала формируют клетки FP-предшественников путем активации канонической передачи сигналов Wnt с небольшой молекулы CHIR99021 и звуковой еж сигнализации с малых молекул SAG и purmorphamine. Эти FP клетки выразить Foxa2, LMX1a, Корин, Otx2 и нестин. Мы тогда определенном эти FP клетки к DA нейронов с факторами роста, включая BDNF, GDNF, и т.д.. Сформированные DA нейроны имеют A9 типа клеток, поскольку они являются позитивными для GIRK2 а отрицательный для кальбиндин ^17. Этот протокол подачи клетка или EB независимо, высокой эффективностью и воспроизводимостью. Используя этот протокол, можно получить DA нейроны менее чем за 4 недели от ЭСК или hiPSCs нормальных людей для клеточной трансплантационной исследования, или от hiPSCs пациентов с БП для моделирования в пробирке PD или тестирования потенциальных терапевтических агентов для PD.