Réalisé neurone dopaminergique différenciation de cellules pluripotentes humaines souches

Dopaminergique (DA) des neurones peuvent être trouvés dans plusieurs régions du cerveau, y compris le mésencéphale, hypothalamus, la rétine et bulbes olfactifs. Les neurones DA A9 dans la substantia nigra pars compacta (SNpc) et un comportement de commande de mouvement en projetant dans le striatum du cerveau antérieur et formant le système moteur extrapyramidal. La dégénérescence des neurones DA A9 conduit à la maladie de Parkinson (PD), qui est la deuxième maladie neurodégénérative humaine la plus courante et actuellement incurable. la thérapie de remplacement cellulaire est l'une des stratégies les plus prometteuses pour le traitement de PD ^1, par conséquent, il ya eu un grand intérêt pour dériver neurones A9 DA à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs), y compris les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et la cellules dernières anthropiques souches pluripotentes (hiPSCs).

Beaucoup de recherches ont tenté de tirer les neurones A9 DA de hPSCs en utilisant diverses méthodes. Les premiers rapports tous les neurones DA générés par un neuronalstade rosette progénitrices. En co-culture avec MS5 ² ou PA6 ^3-5 cellules stromales avec ou sans facteurs de croissance externe pour 2-4 semaines, L. Studer et collègues et trois autres groupes induits succès CSEh pour produire des rosettes de neurones. Ils ont ensuite enrichi ces rosettes par dissection mécanique ou digestion enzymatique pour une différenciation plus poussée. Dans d'autres rapports, les chercheurs ont généré des rosettes de neurones par corps embryoïdes (EB) la différenciation de culture ^6-9 flottants. Par la suite, les chercheurs ont établi un procédé de différenciation de la monocouche à base de ^10,11, où ils étalées cellules hES et hiPSCs sur la matrice extra-cellulaire, ajouter différents facteurs de croissance dans la culture pour induire la différenciation de hPSCs de neurones dopaminergiques, qui imite l'vivo DA embryonnaire du développement dans des neurones . Bien que toutes ces études obtenus tyrosine hydroxylase (TH) cellules exprimant certaines caractéristiques des neurones dopaminergiques, le processus de différenciation ensemble est temps et de travail consommant,généralement inefficaces, et plus important encore, l'identité A9 de ces neurones n'ont pas été démontrée dans la plupart des études, sauf celle avec Lmx1a expression ectopique ^12. Récemment, une nouvelle plaque de plancher (FP) du protocole à base a été développé ^13-16, dans lequel les précurseurs de PF avec DA potentiel de neurone ont d'abord été générés par l'activation de la sonic hedgehog et canoniques voies de signalisation Wnt au cours de la phase précoce de la différenciation, puis ces cellules PF ont été précisées pour les neurones dopaminergiques. Bien que ce protocole est plus efficace, il ya encore quelques problèmes; par exemple, l'ensemble du processus de différenciation prend beaucoup de temps (au moins 35 jours) et de cellules nourricières est dépendante ^15, ou EB est dépendante de l'identité ou de ¹⁶ A9 ¹⁴ n'a pas été démontrée.

Ici, sur la base de la connaissance de in vivo développement embryonnaire DA neurone et les résultats publiés d'autres chercheurs de, nous avons optimisé les conditions de culture pour l'effgénération isant des neurones dopaminergiques de deux CSEh et hiPSCs. Nous avons généré des cellules précurseurs première FP par l'activation de la signalisation Wnt canonique avec une petite molécule et CHIR99021 signalisation Sonic Hedgehog avec de petites molécules et purmorphamine SAG. Ces cellules expriment PF FOXA2, Lmx1a, CORIN, OTX2 et nestine. Nous avons ensuite précisé ces cellules PF à neurones dopaminergiques avec des facteurs de croissance, y compris BDNF, GDNF, etc. Les neurones dopaminergiques sont générés de A9 type de cellule car ils sont positifs pour GIRK2 tout négatif pour Calbindin ^17. Ce protocole est une cellule d'alimentation ou EB indépendante, hautement efficace et reproductible. En utilisant ce protocole, on peut dériver neurones DA en moins de 4 semaines à partir de CSEh ou hiPSCs des personnes normales pour l'étude de la transplantation de cellules, ou de hiPSCs de patients parkinsoniens pour la modélisation in vitro de PD ou de tester des agents thérapeutiques potentiels pour PD.