Geregisseerd Dopaminerge Neuron Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen

Dopamine (DA) neuronen te vinden in verscheidene hersengebieden, waaronder de middenhersenen, hypothalamus, retina en reukkwabben. De A9 DA neuronen in de substantia nigra pars compacta (SNpc) controle gedrag en beweging door het projecteren naar het striatum in de voorhersenen en de vorming van het extrapiramidale motorische systeem. Degeneratie van de A9 DA neuronen leidt tot de ziekte van Parkinson (PD), dat is de tweede meest voorkomende menselijke neurodegeneratieve aandoening en op dit moment ongeneeslijk. Vervangende Celtherapie is een van de meest veelbelovende strategieën voor de behandeling van PD ^1, derhalve is er een grote belangstelling voor het afleiden A9 DA neuronen tegen humane pluripotente stamcellen (hPSCs) geweest, zowel humane embryonale stamcellen (hESCs) en recente humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs).

Veel onderzoek is geprobeerd om A9 DA neuronen ontlenen hPSCs met behulp van verschillende methoden. De eerste rapporten alle gegenereerde DA neuronen via een neuralerozet voorlopercellen podium. Door co-kweken met MS5 ² of PA6 ^3-5 stromale cellen met of zonder externe groeifactoren voor 2-4 weken, L. Studer en collega's en drie andere groepen met succes geïnduceerde hESCs neurale rozetten produceren. Vervolgens verrijkt deze rozetten met mechanische ontleding of enzymatische digestie voor verdere differentiatie. In andere rapporten, onderzoekers gegenereerd neurale rozetten door embryoid lichaam (EB) drijvende cultuur differentiatie ^6-9. Later, onderzoekers werd een monolaag gebaseerd differentiatie werkwijze ^10,11, waar ze uitgeplaat hESCs en hiPSCs op extracellulaire matrix, verschillende groeifactoren toegevoegd aan de kweek tot de differentiatie van hPSCs DA neuronen, die de in vivo embryonale DA neuron ontwikkeling nabootst induceren . Hoewel al deze studies verkregen tyrosine hydroxylase (TH) -expressie cellen met een aantal kenmerken van DA neuronen, het hele proces van differentiatie is tijd en arbeid consumeren,algemeen inefficiënt, en nog belangrijker, werden de A9 identiteit van deze neuronen niet aangetoond in de meeste studies behalve degene met LMX1a ectopische expressie ^12. Onlangs is een nieuwe vloerplaat (FP) gebaseerde protocol ontwikkeld ^13-16, waarbij de FP voorlopers met DA neuron potentiële eerst werden gegenereerd door activering van de sonic hedgehog en Wnt signaalpaden in een vroeg stadium van differentiatie, en deze FP cellen werden verder gespecificeerd naar DA neuronen. Hoewel dit protocol efficiënter, zijn er nog problemen; bijvoorbeeld, de hele differentiatieproces kost tijd (ten minste 35 dagen) en feeder celafhankelijke ^15, of EB afhankelijk ¹⁶ of A9 identiteit niet aangetoond ^14.

Hier, op basis van de kennis van in-vivo embryonale DA neuron ontwikkeling en de gepubliceerde resultaten van andere onderzoekers, we hebben de kweekomstandigheden voor de eff geoptimaliseerdeicient generatie DA neuronen van zowel hESCs en hiPSCs. We hebben eerst gegenereerd FP voorloper cellen door activering van het Wnt-signalering met op kleine moleculen CHIR99021 en sonic hedgehog signalering met kleine moleculen SAG en purmorphamine. Deze FP-cellen brengen FOXA2, LMX1a, CORIN, OTX2 en nestine. We hebben toen aangegeven deze FP cellen naar DA neuronen met groeifactoren zoals BDNF, GDNF, etc. De gegenereerde DA neuronen van A9 celtype als ze positief voor GIRK2 maar negatief voor Calbindin ^17. Dit protocol is feeder cel of EB onafhankelijke, zeer efficiënte en reproduceerbaar. Met dit protocol kan men afleiden DA neuronen in minder dan 4 weken van hESCs of hiPSCs normale personen voor celtransplantatie, of hiPSCs PD patiënten in vitro modellen van PD of testen van potentiële therapeutische middelen voor PD.