בימוי דופאמין Neuron בידול מתאי גזע pluripotent האדם

ניתן למצוא נוירונים דופאמין (DA) במספר אזורים במוח, כולל המוח התיכון, ההיפותלמוס, רשתית, ונורות חוש הריח. נוירונים A9 DA בסעיפי nigra substantia compacta (SNpc) שליטת ההתנהגות ותנועה על ידי הקרנה לסטריאטום במוח הקדמי ולהרכיב את המערכת המוטורית אקסטרה. ניוון של תאי עצב A9 DA מוביל למחלת פרקינסון (PD), המהווה את ההפרעה השנייה בשכיחותה האנושית ניווניות וחשוכות מרפא כיום. טיפול בתחליפי תא הוא אחת האסטרטגיות המבטיחות ביותר לטיפול במחלת פרקינסון ^1, ולכן, חלה התעניינות רבה בנובעים נוירונים A9 DA מתאי גזע pluripotent אנושיים (hPSCs), כולל שני תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ו התאים אחרונים אנושיים מושרה גזע pluripotent (hiPSCs).

מחקרים רבים ניסו להפיק תאי עצב A9 DA מhPSCs תוך שימוש בשיטות שונות. דיווחים המוקדמים כל הנוירונים DA שנוצרו באמצעות עצבישלב אב שושנה. על ידי שיתוף culturing עם MS5 ² או PA6 ^3-5 תאי סטרומה, עם או בלי גורמי גדילה חיצוניים ל2-4 שבועות, ל 'Studer ועמיתים ושלוש קבוצות אחרות מושרה בהצלחה hESCs לייצר רוזטות העצבית. לאחר מכן הם העשירו את רוזטות אלה על ידי נתיחה מכאנית או עיכול אנזימטי להבחנה נוספת. בדיווחים אחרים, חוקרים שנוצרו רוזטות העצבית דרך גוף embryoid (EB) צף בידול תרבות ^6-9. מאוחר יותר, חוקרים שהוקמו בשיטת monolayer מבוססת בידול ^10,11, שבו הם מצופים hESCs וhiPSCs על מטריצה ​​סלולרית נוספת, הוסיפו גורמי גדילה שונים בתרבות כדי לגרום להתמיינות של hPSCs לתאי עצב DA, אשר מחקה בפיתוח נוירון DA העוברי vivo . למרות שכל המחקרים הללו הושגו hydroxylase טירוזין (TH) תאי -expressing עם כמה מאפיינים של תאי עצב DA, תהליך ההתמיינות כל הוא זמן רב ועבודה,בדרך כלל לא יעיל, ויותר מכך, זהות A9 של נוירונים אלה לא באו לידי ביטוי במרבית המחקרים מלבד אחד עם ביטוי אקטופי LMX1a ^12. לאחרונה, צלחת רצפה חדשה (FP) פרוטוקול מבוסס פותחה ^13-16, שבו מבשרי FP עם פוטנציאל נוירון DA נוצרו לראשונה על ידי הפעלה של הקיפוד הקולי ומסלולי Wnt הקנונית איתות בשלב המוקדם של בידול, ולאחר מכן תאי FP אלה שצוינו בהמשך לתאי עצב DA. למרות שפרוטוקול זה הוא יעיל יותר, יש עדיין כמה בעיות; למשל, תהליך ההתמיינות השלם לוקח זמן רב (לפחות 35 ימים), והוא תא המזין תלוי ^15, או היא EB תלויה ¹⁶ או זהות A9 לא הפגינה ^14.

כאן, המבוססים על הידע מפיתוח in vivo עוברי תא עצב DA והתוצאות שפורסמו של חוקרים אחרים, יש לנו מותאם לתנאי התרבות לeffדור icient של נוירונים DA משני hESCs וhiPSCs. אנחנו שנוצרנו ראשון תאי מבשר FP על ידי הפעלה של האיתות של Wnt הקנונית עם המולקולה קטנה CHIR99021 וסוניק קיפוד איתות עם מולקולות קטנות SAG וpurmorphamine. תאי FP אלה מבטאים FOXA2, LMX1a, קורין, OTX2 וNestin. לאחר מכן, אנו שצוינו תאי FP אלה לתאי עצב DA עם גורמי צמיחה כולל BDNF, GDNF, וכו '. נוירונים DA שנוצרו הם מסוג תא A9 כפי שהם חיוביים לGIRK2 תוך שלילי לCalbindin ^17. פרוטוקול זה הוא תא מזין או עצמאי EB, יעיל ומאוד לשחזור. שימוש בפרוטוקול זה, אחד יכול להפיק תאי עצב DA בפחות מ -4 שבועות מhESCs או hiPSCs של אנשים רגילים למחקר השתלת תאים, או מhiPSCs של חולי פרקינסון לדוגמנות במבחנה של PD או בדיקת סוכנים טיפוליים פוטנציאליים עבור PD.