Dirigida dopaminérgica Neurona La diferenciación de las células madre pluripotentes humanas

Dopaminérgico (DA), las neuronas se pueden encontrar en varias regiones del cerebro, incluyendo el cerebro medio, el hipotálamo, la retina y bulbos olfativos. Las neuronas A9 de DA en la substantia nigra pars compacta (SNpc) controlar el comportamiento y el movimiento mediante la proyección en el cuerpo estriado en el cerebro anterior y formando el sistema motor extrapiramidal. La degeneración de las neuronas DA A9 conduce a la enfermedad de Parkinson (PD), que es el segundo trastorno neurodegenerativo más común humano y actualmente incurable. Terapia de reemplazo celular es una de las estrategias más prometedoras para el tratamiento de la EP ^1, por lo tanto, ha habido un gran interés en la obtención de las neuronas DA A9 a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs), incluyendo tanto las células madre embrionarias humanas (hESCs) y el células recientes de origen humano madre pluripotentes (hiPSCs).

Muchas investigaciones han tratado de derivar neuronas DA A9 de hPSCs utilizando diversos métodos. Los primeros informes de todas las neuronas DA generados a través de una neuraletapa progenitor roseta. Por co-cultivo con MS5 ² o PA6 ^3-5 células estromales con o sin factores de crecimiento externo para 2-4 semanas, L. Studer y colegas y otros tres grupos inducidos con éxito hESCs para producir rosetas neuronales. A continuación, enriquecidos estas rosetas por la disección mecánica o digestión enzimática para su posterior diferenciación. En otros informes, los investigadores generaron rosetas neuronales a través del cuerpo embrioide (EB) la diferenciación de la cultura ^6.9 flotantes. Más tarde, los investigadores establecieron un método de diferenciación monocapa basada ^10,11, donde se sembraron hESCs y hiPSCs en matriz extracelular, añadieron diferentes factores de crecimiento en el cultivo para inducir la diferenciación de hPSCs a las neuronas DA, que imita el desarrollo in vivo de las neuronas DA en embrionario . Aunque todos estos estudios obtuvieron tirosina hidroxilasa (TH) células que expresaban con algunas características de las neuronas DA, todo el proceso de diferenciación es que consume tiempo y trabajo,generalmente ineficientes, y más importante, la identidad A9 de estas neuronas no se demostró en la mayoría de los estudios, excepto el uno con LMX1A expresión ectópica ^12. Recientemente, una nueva placa de piso (FP) basada en protocolo se desarrolló ^13-16, en el que los precursores de PF con potencial de neuronas DA se generaron por primera vez por la activación de la erizo sónico y las vías canónicas de señalización Wnt durante la etapa temprana de la diferenciación, y luego estas células de PF se especificaron aún más a las neuronas DA. Aunque este protocolo es más eficiente, todavía hay algunos problemas; por ejemplo, todo el proceso de diferenciación toma mucho tiempo (al menos 35 días) y es alimentador celular dependiente ^15, o es dependiente de EB ¹⁶ o la identidad A9 no se demostró ^14.

Aquí, a partir del conocimiento de in vivo el desarrollo de las neuronas DA embrionario y resultados publicados de otros investigadores, hemos optimizado las condiciones de cultivo para la efciente generación de neuronas DA de ambos hESCs y hiPSCs. Se generó por primera vez las células precursoras FP por la activación de la señalización de Wnt canónica con la pequeña molécula de CHIR99021 y sonic hedgehog de señalización con moléculas pequeñas SAG y purmorphamine. Estas células expresan FP FOXA2, LMX1A, CORIN, OTX2 y Nestin. A continuación, especificamos estas células FP a las neuronas DA con factores de crecimiento incluyendo BDNF, GDNF, etc. Las neuronas DA generados son del tipo de células A9 ya que son positivos para GIRK2 mientras negativo para Calbindin ^17. Este protocolo es de células de alimentación o EB independiente, altamente eficiente y reproducible. El uso de este protocolo, se puede derivar neuronas DA en menos de 4 semanas a partir de hESCs o hiPSCs de las personas normales para el estudio de trasplante de células, o de hiPSCs de los pacientes con EP para el modelado in vitro de la EP o probar agentes terapéuticos potenciales para la EP.