재조합 셀룰라아제 Cel5A의 표현에서<em> 트리코더마 reesei</em> 담배 식물에서
Summary
담배 식물은 일시적 발현 시스템을 통해, 진균 셀룰라아제, TrCel5A을 제조 하였다. 발현은 형광 융합 단백질을 사용하여 모니터링 할 수 있고, 단백질 활성은 사후 발현 분석되었다.
Abstract
셀룰로오스 분해 효소, 셀룰라아제는 연구와 산업의 이익 모두 대상입니다. 그러한 균사 구축 진균류 및 혐기성 세균과 같은 어려운 배양 생물, 이러한 효소의 우세는,이 분야에서 재조합 기술의 사용을 재촉하고있다. 식물 발현 방법은 효소 및 기타 산업적으로 유용한 단백질의 대규모 생산을위한 바람직한 시스템이다. 여기서,는 담배 tabacum에서 곰팡이 endoglucanase, 트리코더마 reesei Cel5A의 일시적 발현을위한 방법이 설명되어 있습니다. 성공적인 단백질 발현은 mCherry 효소 융합 단백질을 사용하여 형광 모니터링 도시된다. 또한 기본적인 테스트 세트는 일시적 발현 T.의 활성을 조사하는 데 사용 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯, zymography뿐만 아니라 형광 염료 계 기질 분해 분석법 등 reesei Cel5A. 여기에 설명 된 시스템은 활성 세포를 생산하는 데 사용될 수있다짧은 시간주기에서 ulase, 구성 적 또는 유도 성 발현 시스템을 통해 식물에 추가 생산 잠재력을 평가하도록.
Introduction
리그 노 셀룰로오스 바이오 매스 액체 연료로의 전환의 저하는 화석 연료에 대한 의존도를 줄일 수있는 방법으로 구상하고있다. 경제성 매스 처리 시스템을 확립 한 가지 중요한 장애물은 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스 (1)의 효소 적 분해에있다. 식물 발현 시스템은 산업 규모에 효소의 생산을위한 큰 잠재력을 보여줍니다. 그들은 수천 년 동안왔다으로 수확 식물 경제적 볼륨에 농업 시스템이 이미 설치되어 있습니다. 식물에서 셀룰라아제의자가 가수 분해에 의한 생산은 2의 용이성 및 식물 세포벽 하나의 소화성을 증가시켜 하부 효소 수준의 사용을 최대화하기위한 전위와 같은 요인들에 바람직하다. 마지막으로, 식물 시스템은 식물 세포의 특정 영역에 대한 재조합 단백질의 타겟팅을 허용하고 세 posttranslationally 필요한 효소를 수정할 수있다.
"ve_content>된 담배 (담배)은 매우 일반적으로 인해 빠른 성장과 바이오 매스 축적 기능 4, 식물의 이종 단백질 발현 연구를위한 모델 생물로 사용됩니다. 재조합 단백질의 일시적 발현은 현지화으로 유연성을 유지하고, 따라서 선택된 단백질, 즉 셀룰라아제의 번역 후 변형 동안에, 짧은 시간 기간 5에서 단백질 생산을 가능하게하는 기술이다. 또한 식물에서 더 표현 전략을위한 기반을 마련하면서는 기본적인 분석을위한 셀룰라아제 (들)의 생산을 가능하게한다. 이러한 일시적 발현 전략을 사용하여, 진균 숙주 트리코더마 reesei (Hypocrea의 jecorina)로부터 유도 된 글리코 하이드 롤라 가족 05 Cel5A, 6 endoglucanase은 (이하 TrCel5A라고 함) 제조된다. TrCel5A는 기본적으로 당화 된 42 kDa의 단백질과 유압에 매우 활성화되어셀룰로오스 사슬 7을 roylzing.
여기에 설명 된 일시적 발현 기술은 식물 아그로 박테리아는 적절한 발현 벡터에 대한 관심의 유전자를 운반 남긴다 침윤, 비교적 널리 사용되는 시스템에 기초한다. 란타 식 성공의 신속한 분석을 허용하기 위해 TrCel5A 또한 mCherry 원래 Discosoma SP에 유래 모노머 형광 단백질과 융합 단백질로서 발현 될 수있다. 단백질에 융합 된 추가적인 여섯 히스티딘 (그의 태그)와, 8 DsRed를 C-말단 (TrCel5A – mCherry). 이종 융합 단백질, TrCel5A – mCherry의 표현 따라서 mCherry 분산을 검토하는 녹색 빛을 사용하여 식물 성장에서 모니터링 할 수 있습니다. 원하는 경우, 식물 재료의 얇은 부분은 단백질의 특정 지역화를 확립 녹색광 현미경으로 관찰 할 수있다. 이 작품, 신호 전송 용앉아 펩티드는 소포체 9 이종 단백질의 수출을 집중하기 위해, 구조에 통합되었다.
셀룰라아제 활성 시험의 수가 실행될 수 TrCel5A 포함한 식물 발현 셀룰라아제의 활성을 분석한다. 전체 수용성 식물 단백질 추출 후 TrCel5A 부분적 열 배양 기술을 이용하여 정제 할 수있다. 단백질의 크기는 웨스턴 블로 팅 다음 SDS-PAGE를 사용하여 설정됩니다. 용해도 10 : (CMC 카르복시 메틸 셀룰로오스를 만드는) Zymography는 기판, 카르복시 메틸화왔다 예 셀룰로오스 대 활성을 분석하기 위해 사용될 수있다. 셀룰라아제 및 글루코시다 활동 (: 4-MUC 결합) β-D-cellobioside과 관련된 형광 물질 4 – 메틸 움 (4-MU)를 사용하여 모니터링 할 수 있습니다. endoglucanase 활동을 평가하는 또 다른 방법은 아조-D와 연결되었습니다 CMC의 분광 분석을 포함너희 (Remazolbrilliant 블루 R) 11. 또, endoglucanases 및 셀룰라아제의 범위 모두의 단백질 활성은 P-하이드 록시 벤조산 하이 드라 자이드 (PAHBAH) 분석으로서 12 설탕 분석 시험의 사용에 의해 모니터링 될 수있다. 이러한 기술은 또한 표현 셀룰라아제의 활성을 규명하고 정량화 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
셀룰라아제의 재조합 발현으로 인해보다 효율적인 바이오 연료 생산 시스템 1에 대한 욕구에 큰 관심 분야입니다. 식물은 경제 수확 기술과 대규모 바이오 연료 생산을위한 매우 바람직한 특성 인자가 가수 분해 방법 등의 기능과 함께, 성공 셀룰라아제 생산을위한 많은 가능성을 제공합니다. 또한, 단백질을 제조하기위한 다른 언어 버전의 사용이 필요한 경우, 번역 후 변형 (20)에게<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 BMBF Forschungsinitiative에 의해 지원되었다 "BioEnergie 2021 – Forschung 모피 Nutzung 폰 Biomasse 다이"과학을 촉진하기 위해 독일 연방 정부 및 주 정부의 우수 이니셔티브 재정 지원을 통해 우수 "바이오 매스에서 맞춤형 연료"의 클러스터 독일 대학의 연구.
Materials
| 4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside | SIGMA-ALDRICH | M6018 | |
| Acetic acid | ROTH | 3738 | |
| Acetosyringon (concentrated) | ROTH | 6003 | |
| Antibiotic – kanamycin | ROTH | T832 | |
| Antibiotic – rifampicin | ROTH | 4163 | |
| Antibiotic – carbenicillin | ROTH | 6344 | |
| Antibody – rabbit anti His(6) pAb | ROCKLAND | 600-401-382 | |
| Antibody – goat anti rabbit AP, FC pAb | DIANOVA | 111-055-008 | |
| Azo-carboxymethyl cellulose | MEGAZYME | S-ACMC | |
| β-cyclodextrin | SIGMA-ALDRICH | C4805 | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA-ALDRICH | C5080 | |
| Carboxymethyl cellulose | ROTH | 3333.1 | |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | SIGMA-ALDRICH | C2730 | |
| Congo red | SIGMA-ALDRICH | 75768 | |
| Coomasie brilliant blue G 250 | ROTH | 9598.2 | |
| D(+)-glucose | ROTH | 8337 | |
| Ethanol | ROTH | K928 | |
| Filter paper – Rotilabo blotting paper | ROTH | CL67 | |
| NBT/BCIP | SIGMA-ALDRICH | 72091 | |
| MES buffer | ROTH | 4256 | |
| Methanol | ROTH | 8388 | |
| Sodium citrate | ROTH | 3580 | |
| Sodium dodecylsulfate | SERVA | 20765 | |
| Sodium hydroxide | ROTH | 6771 | |
| Soil, Einheitserde classic | PATZER GMBH | ||
| Spectrometer – Infinite M200 | TECAN | ||
| Sucrose | SIGMA-ALDRICH | S-5390 | |
| 4-Hydroxy benzhydrazide | SIGMA-ALDRICH | H9882 | |
| Phosphate buffered saline | ROTH | 1058 | |
| UV light source – BLAK RAY | UVP | ||
| Vibratome – VT1000S | Leica |
References
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