Expressie van recombinant Cellulase Cel5A uit<em> Trichoderma reesei</em> In tabaksplanten
Summary
Tabaksplanten werden gebruikt om een schimmel cellulase, TrCel5A produceren via een tijdelijk expressiesysteem. De uitdrukking zou kunnen worden gecontroleerd met behulp van een fluorescerende fusie-eiwit, en het eiwit activiteit werd gekenmerkt post-expressie.
Abstract
Cellulose afbrekende enzymen, cellulasen, zijn doelwit van zowel onderzoek en industriële belangen. Het overwicht van deze enzymen op moeilijk-cultuur organismen, zoals hyfen opbouw schimmels en anaërobe bacteriën is bespoedigd het gebruik van recombinante technologieën op dit gebied. Plant expressiewerkwijzen zijn gewenst voor grootschalige productie van enzymen en andere industrieel bruikbare eiwitten. Hierin werkwijzen voor de transiënte expressie van een endoglucanase schimmel, Trichoderma reesei Cel5A in Nicotiana tabacum worden gedemonstreerd. Succesvolle eiwitexpressie blijkt, gecontroleerd door fluorescentie met een mCherry-enzym fusieproteïne. Bovendien, een aantal standaard tests worden gebruikt om de activiteit van tijdelijk tot expressie T. onderzocht reesei Cel5A, waaronder SDS-PAGE, Western blotting, zymografie, evenals fluorescentie en kleurstoffen gebaseerde substraat degradatie assays. Het hier beschreven systeem kan worden gebruikt om een actieve cel producerenUlase in een korte tijdsperiode, om het potentieel voor verdere productie in planten te evalueren door constitutieve of induceerbare expressiesystemen.
Introduction
Afbraak van lignocellulose biomassa en het aanmaken van vloeibare brandstof is voorgesteld als een methode om afhankelijkheid van fossiele brandstoffen. Een belangrijke hindernis bij het vaststellen economisch haalbare biomassa-systemen in de enzymatische afbraak van cellulose en hemicellulose 1. Plant expressiesystemen enorme mogelijkheden voor de productie van enzymen op industriële schaal. Landbouwsystemen te oogsten planten economisch als in volume zijn al gevestigd, zoals ze al duizenden jaren zijn geweest. De productie van cellulasen in planten gewenst door factoren zoals het gemak van autohydrolysis 2, en de mogelijkheden voor maximalisering van het gebruik van lagere enzym niveaus door het verhogen van de verteerbaarheid van plantaardige celwanden 1. Tot slot, plantaardige systemen maken het mogelijk de targeting van recombinante eiwitten naar specifieke gebieden van plantencellen en zijn in staat om enzymen waar vereist 3 posttranslationeel wijzigen.
ve_content ">Nicotiana tabacum (tabak) wordt zeer vaak gebruikt als modelorganisme voor heterologe eiwitexpressie studies in planten, vanwege de snelle groei en biomassa accumulatie functies 4. Tijdelijke expressie van recombinante eiwitten is een techniek die eiwitproductie mogelijk maakt in korte perioden 5, met behoud van flexibiliteit om de lokalisatie en dus posttranslationele modificaties van de geselecteerde eiwitten, namelijk cellulasen. Dit maakt de productie van de cellulase (s) voor basis-analyse, terwijl ook de basis te leggen voor verdere expressie strategieën in planten. Met dergelijke transiënte expressie strategie is een endoglucanase van glycosyl hydrolase familie 5, Cel5A, afgeleid van de schimmelgastheer Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) 6 geproduceerd (hierna TrCel5A). TrCel5A is een 42 kDa eiwit dat natief geglycosyleerd en is zeer actief in hydroylzing celluloseketens 7.
De tijdelijke expressie techniek die hier beschreven is gebaseerd op relatief gebruikte systeem, infiltreren de bladeren met Agrobacterium die het gen van belang in een geschikte expressievector. Te zorgen voor een snelle analyse van succesvolle in planta expressie, kan TrCel5A ook worden uitgedrukt als een fusie-eiwit met mCherry, een monomeer fluorescerend eiwit oorspronkelijk afkomstig van Discosoma sp. Eiwit DsRed 8, met een extra zes Histidineresten (His-tag) gefuseerd met de C-terminus (TrCel5A-mCherry). Expressie van het heterologe fusie-eiwit, TrCel5A-mCherry kunnen dus worden gecontroleerd in de groeiende plant met groen licht mCherry verspreiding te onderzoeken. Desgewenst kunnen dunne secties van het plantenmateriaal met groen licht worden microscopisch onderzocht op de specifieke lokalisatie van het eiwit vast. Voor dit werk, signaal en tranzitten peptiden werden opgenomen in het construct, om het heterologe eiwit export naar het endoplasmatisch reticulum 9 lokaliseren.
Om de activiteit van plantaardige expressie cellulasen, zoals TrCel5A een aantal cellulase activiteit testen kunnen uitgevoerd worden geanalyseerd. Na de winning van de totale oplosbare plantaardige eiwitten, kan TrCel5A gedeeltelijk worden gezuiverd met behulp van een thermische incubatie techniek. Eiwit maat wordt ingesteld met behulp van SDS-PAGE gevolgd door Western blotting. Zymografie kan worden gebruikt om de activiteit te analyseren tegen substraten, bijv. cellulose die carboxy-gemethyleerd is (waardoor carboxymethylcellulose CMC) voor oplosbaarheid 10. Cellulase en glucosidase activiteit kan worden gecontroleerd met de fluorofoor 4-methylumbelliferyl (4-MU) geassocieerd met β-D-cellobioside (gecombineerde 4-MUC). Een andere methode om endoglucanase activiteit bij omvat de spectrometrische analyse CMC die is geassocieerd met een azo-dgij (Remazolbrilliant Blue R) 11. Daarnaast kunnen eiwit activiteit van zowel endoglucanasen en verschillende cellulasen worden gecontroleerd door het gebruik van een suiker analysetest, zoals p-hydroxybenzoëzuur hydrazide (PAHBAH) test 12. Deze technieken kunnen gebruikt worden om op te helderen en kwantificeren van de activiteit van de tot expressie gebrachte cellulase plaats.
Protocol
Representative Results
Discussion
Recombinante expressie van cellulasen is een gebied van groot belang, vanwege het verlangen naar efficiëntere biobrandstoffen productiesystemen 1. Planten bieden vele mogelijkheden voor een succesvolle cellulase productie, met functies zoals economische oogsttechnieken en autohydrolysis methoden zeer wenselijke eigenschappen voor grootschalige productie van biobrandstoffen. Verder, het gebruik van verschillende lokalisaties voor het produceren van eiwitten toestaan, indien nodig, posttranslationele modificat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het BMBF Forschungsinitiative "BioEnergie 2021 – Forschung für die Nutzung von Biomasse" en de Cluster of Excellence 'op maat uit biomassa ", dat wordt gefinancierd door de Excellence initiatief van de Duitse federale en deelstaatregeringen om de wetenschap te bevorderen en onderzoek aan Duitse universiteiten.
Materials
| 4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside | SIGMA-ALDRICH | M6018 | |
| Acetic acid | ROTH | 3738 | |
| Acetosyringon (concentrated) | ROTH | 6003 | |
| Antibiotic – kanamycin | ROTH | T832 | |
| Antibiotic – rifampicin | ROTH | 4163 | |
| Antibiotic – carbenicillin | ROTH | 6344 | |
| Antibody – rabbit anti His(6) pAb | ROCKLAND | 600-401-382 | |
| Antibody – goat anti rabbit AP, FC pAb | DIANOVA | 111-055-008 | |
| Azo-carboxymethyl cellulose | MEGAZYME | S-ACMC | |
| β-cyclodextrin | SIGMA-ALDRICH | C4805 | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA-ALDRICH | C5080 | |
| Carboxymethyl cellulose | ROTH | 3333.1 | |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | SIGMA-ALDRICH | C2730 | |
| Congo red | SIGMA-ALDRICH | 75768 | |
| Coomasie brilliant blue G 250 | ROTH | 9598.2 | |
| D(+)-glucose | ROTH | 8337 | |
| Ethanol | ROTH | K928 | |
| Filter paper – Rotilabo blotting paper | ROTH | CL67 | |
| NBT/BCIP | SIGMA-ALDRICH | 72091 | |
| MES buffer | ROTH | 4256 | |
| Methanol | ROTH | 8388 | |
| Sodium citrate | ROTH | 3580 | |
| Sodium dodecylsulfate | SERVA | 20765 | |
| Sodium hydroxide | ROTH | 6771 | |
| Soil, Einheitserde classic | PATZER GMBH | ||
| Spectrometer – Infinite M200 | TECAN | ||
| Sucrose | SIGMA-ALDRICH | S-5390 | |
| 4-Hydroxy benzhydrazide | SIGMA-ALDRICH | H9882 | |
| Phosphate buffered saline | ROTH | 1058 | |
| UV light source – BLAK RAY | UVP | ||
| Vibratome – VT1000S | Leica |
References
- Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
- Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development. Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).
- Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion. Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).
- Sharma, A. K., Sharma, M. K. Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities. Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).
- Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins. Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).
- Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A. Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).
- Saloheimo, M., et al. EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme. Gene. 63, 11-21 (1988).
- Davidson, M. W., Campbell, R. E. Engineered fluorescent proteins: innovations and applications. Nature Methods. 6, 713-717 (2009).
- Pelham, H. R. The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum. Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).
- Béguin, P. Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas. Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).
- Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides. Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).
- Lever, M. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).
- Maclean, J., et al. Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).
- Munro, S., Pelham, H. R. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell. 48, 899-907 (1987).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets – procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).
- Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).
- Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).
- Sammond, D. W., et al. Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation. PLoS One. 7, (2012).
- Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O’Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica. Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).
