Expresión recombinante de celulasa de Cel5A<em> Trichoderma reesei</em> En plantas de tabaco

La degradación de la biomasa lignocelulósica y su conversión en combustible líquido ha sido concebido como un método para reducir la dependencia de los combustibles fósiles. Un obstáculo importante en el establecimiento de sistemas de procesamiento de biomasa económicamente viables es en la degradación enzimática de la celulosa y la hemicelulosa ^1. Sistemas de expresión de la planta muestran un gran potencial para la producción de enzimas a escala industrial. Los sistemas agrícolas a las plantas de cosecha económica y en el volumen ya están establecidos, como lo han sido durante miles de años. La producción de celulasas en las plantas es deseable debido a factores como la facilidad de autohidrólisis ^2, y el potencial para maximizar el uso de niveles más bajos de la enzima mediante el aumento de la digestibilidad de paredes celulares de las plantas ^1. Finalmente, los sistemas de la planta permiten la focalización de proteínas recombinantes a áreas específicas de las células vegetales y son capaces de modificar posttranslationally enzimas cuando sea necesario ^3.

Nicotiana tabacum (tabaco) es muy utilizado como organismo modelo para estudios de expresión de proteínas heterólogas en las plantas, debido a sus características de crecimiento y biomasa rápida acumulación ^4. La expresión transitoria de las proteínas recombinantes es una técnica que permite la producción de proteínas en períodos de tiempo cortos ^5, manteniendo al mismo tiempo la flexibilidad en cuanto a la localización y por lo tanto las modificaciones postraduccionales de las proteínas seleccionadas, es decir, celulasas. Esto permite la producción de la celulasa (s) para el análisis básico, y al mismo tiempo sentar las bases de nuevas estrategias de expresión en plantas. Usando una estrategia de expresión transitoria tal, una endoglucanasa de la familia de glicosil hidrolasa 5, Cel5A, derivado de la fúngica huésped de Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) ⁶ se produce (en lo sucesivo referido como TrCel5A). TrCel5A es una proteína de 42 kDa que está glicosilado de forma nativa y es altamente activo en HYDroylzing cadenas de celulosa ^7.

La técnica de la expresión transitoria descrito aquí se basa en un sistema relativamente utilizado comúnmente, infiltrándose en las hojas de plantas con Agrobacteria lleva el gen de interés en un vector de expresión apropiado. Para permitir un análisis rápido de éxito la expresión in planta, TrCel5A también se puede expresar como una proteína de fusión con mCherry, una proteína fluorescente monomérico derivado originalmente de Discosoma sp. Proteína DsRed ^8, con un adicional de seis residuos de histidina (His-tag) fusionado a el C-terminal (TrCel5A-mCherry). La expresión de la proteína de fusión heteróloga, TrCel5A-mCherry, por tanto, se puede controlar en el cultivo de plantas mediante el uso de la luz verde para examinar mCherry dispersión. Si se desea, las secciones delgadas de material de la planta pueden ser examinados bajo luz verde al microscopio para determinar la localización específica de la proteína. Para este trabajo, la señal y la transentarse péptidos fueron incorporados en la construcción, para localizar la exportación de proteínas heterólogas a la retículo endoplásmico ^9.

Para analizar la actividad de celulasas expresadas de plantas, incluyendo TrCel5A, una serie de pruebas de actividad de celulasa se puede ejecutar. Después de la extracción de las proteínas solubles totales de la planta, TrCel5A puede purificarse parcialmente usando una técnica de incubación térmica. El tamaño de la proteína se estableció utilizando SDS-PAGE seguido por transferencia Western. La zimografía puede ser utilizado para analizar la actividad contra los sustratos, por ejemplo, de celulosa que ha sido carboxi-metilado (haciendo carboximetilcelulosa: CMC) para la solubilidad ^10. Actividad de la celulasa y glucosidasa se puede controlar utilizando el fluoróforo 4-metilumbeliferil (4-MU) asociado con β-D-celobiósido (combinado: 4-MUC). Otro método para evaluar la actividad endoglucanasa implica el análisis de espectrometría de CMC que se ha asociado con un azo-dye (Remazolbrilliant Blue R) ^11. Además, la actividad de proteína de ambos endoglucanasas y una gama de celulasas se puede controlar por el uso de una prueba de análisis de azúcares, tales como la hidrazida p-hidroxi benzoico (PAHBAH) de ensayo ^12. Estas técnicas se pueden utilizar para elucidar y cuantificar la actividad de la celulasa de interés expresada.