組換えセルラーゼCEL5Aの式から<em>トリコデルマ·</em>タバコ植物における

リグノセルロース系バイオマスを液体燃料への変換の劣化が化石燃料への依存を低減する方法として想定されている。経済的に実現可能なバイオマス処理システムを確立する上での一つの重要なハードルは、セルロースとヘミセルロース¹の酵素分解である。植物発現系は、工業的規模での酵素の産生のための大きな可能性を示している。彼らは何千年もの間あったように収穫植物経済的にもボリューム内の農業システムは、すでに確立されています。植物におけるセルラーゼの生産は^、2自己加水分解の容易さ、および植物細胞壁¹の消化率を増加させることによって、より低い酵素レベルの使用を最大にするための電位のような要因に望ましい。最後に、植物系は、植物細胞の特定の領域への組換えタンパク質の標的化を可能にし、翻訳後^3を必要な酵素を変更することができる。

ニコチアナ·タバコ （タバコ）は非常に一般的に、その急速な成長とバイオマス蓄積機能⁴に、植物における異種タンパク質発現の研究のためのモデル生物として使用されます。組換えタンパク質の一過性発現が局在化および選択されたタンパク質の翻訳後修飾、したがって、 即ちセルラーゼのような柔軟性を維持しつつ、短時間⁵におけるタンパク質産生を可能にする技術である。また、植物における発現のさらなる戦略のための基礎を敷設しながら、基本的な分析のためのセルラーゼ（単数または複数）の産生を可能にする。このような一過性発現戦略を用いて、真菌宿主トリコデルマ·リーゼイ （ ハイポクレアジェコリーナ ）由来のグリコシルヒドロラーゼファミリー^{5、CEL5A、6}からエンドグルカナーゼ（以下TrCel5Aと呼ぶ）が生成される。 TrCel5Aはネイティブにグリコシル化されている42 kDaのタンパク質であり、HYDに高活性であるセルロース鎖^7を roylzing。

ここで説明する一過性発現技術は、植物はアグロバクテリウムは 、適切な発現ベクターに目的の遺伝子を保有する葉浸潤、比較的一般的に使用されるシステムに基づいている。 インプランタ発現の成功の迅速な分析を可能にするために、TrCel5AもmCherry、本来ディスコソマ（Discosoma）種に由来する単量体の蛍光タンパク質との融合タンパク質として発現させることができる。タンパク質DsRedは^8、さらに6ヒスチジン残基（Hisタグ）は、に融合してC末端（TrCel5A-mCherry）。異種融合タンパク質、TrCel5A-mCherryの発現は、このようにmCherryの分散を調べるために緑色光を用いて成長した植物内で監視することができる。所望であれば、植物材料の薄い部分は、タンパク質の特異的な局在を確立するために顕微鏡的に緑色光下で検査することができる。この作品、信号TRANのため座るペプチドは、小胞体から⁹異種タンパク質輸送をローカライズするために、構築物に組み込まれた。

TrCel5Aを含む植物発現セルラーゼの活性を分析するために、セルラーゼ活性試験の数を実行することができる。全可溶性植物タンパク質を抽出した後、TrCel5Aは、部分的に熱インキュベーション法を用いて精製することができる。タンパク質サイズは、ウェスタンブロッティング、続いてSDS-PAGEを使用して確立される。溶解度^10：ザイモグラフィーはカルボキシメチル化（CMCカルボキシメチルセルロースの製造）されたセルロース、例えば 、基質に対する活性を分析するために使用することができる。セルラーゼとグルコシダーゼ活性は、（4-MUC合わせた）β-D-セロビオシドに関連付けられたフルオロフォア4 – メチルウンベリフェリル（4-MU）を使用してモニターすることができる。エンドグルカナーゼ活性を評価するための別の方法は、アゾdで関連付けられているCMCの分析を含むあなたがた（Remazolbrilliantブルー^R）11。また、エンドグルカナーゼ及びセルラーゼの範囲の両方のタンパク質の活性は、p-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（PAHBAH）アッセイ¹²などの糖分析試験の使用によりモニターすることができる。これらの技術は、目的の発現セルラーゼの活性を解明し、定量することができる。