التعبير عن المؤتلف سلولاز Cel5A من<em> الترايكوديرما reesei</em> في نباتات التبغ
Summary
واستخدمت نباتات التبغ لإنتاج سلولاز الفطرية، TrCel5A، عبر نظام التعبير عابر. ويمكن رصد التعبير باستخدام انصهار بروتين الفلورسنت، واتسم نشاط البروتين التعبير آخر.
Abstract
الانزيمات المهينة السليلوز، السليلوزات، هي أهداف كل من البحث والمصالح الصناعية. كثرة هذه الإنزيمات في إلى ثقافة الصعب الكائنات الحية، مثل الفطريات بناء خيوط والبكتيريا اللاهوائية، وقد سارعت استخدام التكنولوجيات المؤتلف في هذا المجال. طرق التعبير النباتية هي نظام مرغوب فيه لإنتاج على نطاق واسع من الإنزيمات وغيرها من البروتينات مفيدة صناعيا. هنا، وأظهرت وسائل للتعبير عابر لendoglucanase الفطرية، الترايكوديرما reesei Cel5A، في نيكوتيانا تبغ. ويرد ناجحة التعبير البروتين، ومراقبتها من قبل مضان باستخدام انصهار بروتين mCherry انزيم. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام مجموعة من الاختبارات الأساسية لدراسة نشاط T. أعرب عابر reesei Cel5A، بما في ذلك SDS-PAGE، النشاف الغربية، zymography، فضلا عن مضان والركيزة المقايسات تدهور قائم على الأصباغ. النظام المذكور هنا يمكن أن تستخدم لإنتاج الخلية النشطةulase في فترة زمنية قصيرة، وذلك لتقييم إمكانية زيادة الإنتاج في النباتات من خلال نظم التعبير التأسيسية أو محرض.
Introduction
وقد تصور تدهور الكتلة الحيوية اللجنوسليلوزية وتحولها إلى وقود سائل كوسيلة للحد من الاعتماد على الوقود الأحفوري. واحد عقبة كبيرة في إنشاء نظم معالجة الكتلة الحيوية غير مجدية اقتصاديا في تدهور الأنزيمية من السليلوز وهيميسيلولوز 1. تظهر أنظمة التعبير النبات إمكانات كبيرة لإنتاج الإنزيمات على نطاق صناعي. يتم تأسيس نظم الزراعية للنباتات الحصاد واقتصاديا في حجم بالفعل، كما كانت منذ آلاف السنين. إنتاج السليلوزات في النباتات غير المرغوب فيه بسبب عوامل مثل سهولة حلمهة ذاتية 2، وإمكانية تعظيم الاستفادة من انخفاض مستويات إنزيم عن طريق زيادة هضم جدران الخلايا النباتية 1. أخيرا، مصنع أنظمة تسمح استهداف البروتينات المؤتلف لمجالات محددة من الخلايا النباتية وقادرون على تعديل posttranslationally الانزيمات حيث المطلوبة 3.
ve_content ">يستخدم تبغ النيكوتين (التبغ) الشائع جدا باعتباره النموذج الحي للدراسات بروتين تعبير مغاير في النباتات، ويرجع ذلك إلى النمو والكتلة الحيوية معالمه السريع تراكم 4. التعبير عابرة من البروتينات المؤتلف هو الأسلوب الذي يتيح إنتاج البروتين في فترات زمنية قصيرة 5، مع الحفاظ على المرونة لتوطين وبالتالي تعديلات ما بعد النقل من البروتينات المحددة، أي السليلوزات. وهذا يتيح إنتاج سلولاز (ق) للتحليل الأساسي، في حين وضع أيضا الأساس لمزيد من استراتيجيات التعبير في النباتات. باستخدام هذه الاستراتيجية التعبير عابرة، يتم إنتاج endoglucanase من غليكوزيل هيدرولاز العائلة 5، Cel5A، والمستمدة من المضيف الفطرية الترايكوديرما reesei (Hypocrea jecorina) 6 (المشار إليها فيما يلي باسم TrCel5A). TrCel5A هو 42 كيلو دالتون البروتين الذي الغليكوزيلاتي أصلا وغير نشطة للغاية في HYDroylzing سلاسل السليلوز 7.
ويستند أسلوب التعبير عابرة الموصوفة هنا على نظام نسبيا استخداما، التسلل يترك المصنع مع Agrobacteria تحمل الجينات في المصالح في ناقلات التعبير المناسب. للسماح للتحليل السريع للنجاح في بلانتا التعبير، TrCel5A يمكن أيضا التعبير عن بروتين الانصهار مع mCherry، وهو بروتين فلوري أحادى المستمدة أصلا من Discosoma س. بروتين DsRed 8، إضافة إلى ستة بقايا الحامض الأميني (صاحب العلامة) لتنصهر وC-محطة (TrCel5A-mCherry). وهكذا يمكن رصد تعبير عن انصهار بروتين مغاير، TrCel5A-mCherry، في النباتات التي تنمو باستخدام الضوء الأخضر لدراسة mCherry تشتت. إذا رغبت في ذلك، أقسام رقيقة من المواد النباتية يمكن فحصها تحت المجهر الضوء الأخضر لإقامة توطين محددة من البروتين. لهذا العمل، وإشارة وترانوأدرجت الجلوس الببتيدات في بناء، في توطين تصدير البروتين مغاير للشبكية هيولي باطني 9.
لتحليل نشاط السليلوزات أعرب النباتية، بما في ذلك TrCel5A، يمكن تشغيل عدد من الاختبارات النشاط سلولاز. بعد استخراج من مجموع البروتينات النباتية القابلة للذوبان، TrCel5A يمكن تنقيته جزئيا باستخدام تقنية الحضانة الحرارية. تم تأسيس حجم البروتين باستخدام SDS-PAGE تليها النشاف الغربية. Zymography يمكن استخدامها لتحليل نشاط ضد ركائز، مثل السليلوز الذي كان كربوكسي ميثليته (صنع السليلوز carboxymethyl: CMC) للالذوبان 10. سلولاز وجلوكوزيد النشاط يمكن رصدها باستخدام fluorophore 4-ميثيل مبيليفيريل (4-MU) المرتبطة β-D-cellobioside (مجتمعة: 4-MUC). طريقة أخرى لتقييم النشاط endoglucanase ينطوي على التحليل الطيفي للCMC الذي ارتبط مع الآزو دانتم (Remazolbrilliant الأزرق R) 11. بالإضافة إلى ذلك، كل من نشاط البروتين endoglucanases ومجموعة من السليلوزات يمكن رصدها عن طريق استخدام اختبار تحليل السكر، مثل هيدرازيد ف هيدروكسي البنزويك حمض (PAHBAH) مقايسة 12. هذه التقنيات يمكن استخدامها لتوضيح وتحديد نشاط سلولاز أعرب المصالح.
Protocol
Representative Results
Discussion
التعبير المؤتلف من السليلوزات هو مجال اهتمام كبير، ويرجع ذلك إلى الرغبة في نظم أكثر كفاءة إنتاج الوقود الحيوي 1. النباتات تقدم العديد من الإمكانيات لإنتاج سلولاز ناجحة، مع ميزات مثل تقنيات الحصاد الاقتصادي وأساليب حلمهة ذاتية كونها خصائص مرغوبة جدا لإنتاج الو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل BMBF Forschungsinitiative "BIOENERGIE 2021 – Forschung FÜR يموت Nutzung فون Biomasse" والكتلة التميز "الوقود مصممة خصيصا من الكتلة الحيوية"، الذي يتم تمويله من خلال مبادرة التميز من قبل الحكومات الاتحادية وحكومات الولايات الألمانية لتعزيز العلوم والبحث في الجامعات الألمانية.
Materials
| 4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside | SIGMA-ALDRICH | M6018 | |
| Acetic acid | ROTH | 3738 | |
| Acetosyringon (concentrated) | ROTH | 6003 | |
| Antibiotic – kanamycin | ROTH | T832 | |
| Antibiotic – rifampicin | ROTH | 4163 | |
| Antibiotic – carbenicillin | ROTH | 6344 | |
| Antibody – rabbit anti His(6) pAb | ROCKLAND | 600-401-382 | |
| Antibody – goat anti rabbit AP, FC pAb | DIANOVA | 111-055-008 | |
| Azo-carboxymethyl cellulose | MEGAZYME | S-ACMC | |
| β-cyclodextrin | SIGMA-ALDRICH | C4805 | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA-ALDRICH | C5080 | |
| Carboxymethyl cellulose | ROTH | 3333.1 | |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | SIGMA-ALDRICH | C2730 | |
| Congo red | SIGMA-ALDRICH | 75768 | |
| Coomasie brilliant blue G 250 | ROTH | 9598.2 | |
| D(+)-glucose | ROTH | 8337 | |
| Ethanol | ROTH | K928 | |
| Filter paper – Rotilabo blotting paper | ROTH | CL67 | |
| NBT/BCIP | SIGMA-ALDRICH | 72091 | |
| MES buffer | ROTH | 4256 | |
| Methanol | ROTH | 8388 | |
| Sodium citrate | ROTH | 3580 | |
| Sodium dodecylsulfate | SERVA | 20765 | |
| Sodium hydroxide | ROTH | 6771 | |
| Soil, Einheitserde classic | PATZER GMBH | ||
| Spectrometer – Infinite M200 | TECAN | ||
| Sucrose | SIGMA-ALDRICH | S-5390 | |
| 4-Hydroxy benzhydrazide | SIGMA-ALDRICH | H9882 | |
| Phosphate buffered saline | ROTH | 1058 | |
| UV light source – BLAK RAY | UVP | ||
| Vibratome – VT1000S | Leica |
References
- Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
- Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development. Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).
- Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion. Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).
- Sharma, A. K., Sharma, M. K. Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities. Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).
- Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins. Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).
- Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A. Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).
- Saloheimo, M., et al. EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme. Gene. 63, 11-21 (1988).
- Davidson, M. W., Campbell, R. E. Engineered fluorescent proteins: innovations and applications. Nature Methods. 6, 713-717 (2009).
- Pelham, H. R. The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum. Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).
- Béguin, P. Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas. Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).
- Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides. Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).
- Lever, M. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).
- Maclean, J., et al. Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).
- Munro, S., Pelham, H. R. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell. 48, 899-907 (1987).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets – procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).
- Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).
- Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).
- Sammond, D. W., et al. Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation. PLoS One. 7, (2012).
- Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O’Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica. Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).
