Summary

Rekombinant Cellulase Cel5A İfade itibaren<em> Trichoderma reesei</em> Tütün Bitkilerinde

Published: June 13, 2014
doi:

Summary

Tütün bitkileri, bir geçici ekspresyon sistemi ile, bir fungal selülaz, TrCel5A üretmek için kullanıldı. Ekspresyon, bir floresan füzyon proteini kullanılarak takip edilebilir, ve protein aktivitesi post-ekspresyon karakterize edilmiştir.

Abstract

Selüloz alçaltıcı enzimler arasında, selülazlar, araştırma ve hem de sanayi ilgi hedeflerdir. Bu tür hifler-yapı mantar ve anaerobik bakteriler gibi zor-organizmaların kültür, bu enzimlerin üstünlüğü, bu alanda yeniden birleştirici teknolojilerin kullanımı hızlandırdı. Bitki ifade yöntemleri enzimler ve diğer endüstriyel olarak kullanışlı proteinlerin büyük ölçekli üretimi için arzu edilen bir sistemi vardır. Burada, Nicotiana tabacum bir mantar endoglukanazın, Trichoderma reesei Cel5A arasında geçici ekspresyonu için yöntemler gösterilmektedir. Başarılı bir protein sentezleme mCherry-enzim füzyon proteini kullanılarak floresan ile gözlenmiş gösterilmiştir. Buna ek olarak, temel testler bir dizi geçici ifade T. aktivitesini incelemek için kullanılır SDS-PAGE, Western blotting, zimografi, hem de ve floresan boya bazlı alt-tabaka bozulması deneyleri de dahil olmak üzere reesei Cel5A. Burada anlatılan sistem etkin bir hücre üretmek için kullanılabilirKısa bir süre içinde ulase, kurucu ya da uyarılabilir sentezleme sistemleri ile bitkilerde daha fazla üretim potansiyelini değerlendirmek üzere.

Introduction

Lignoselülozik biyokütle ve sıvı yakıt dönüştürülmesine Bozulması fosil yakıtlara bağımlılığı azaltmak için bir yöntem olarak tasavvur edilmiştir. Ekonomik açıdan biyokütle işleme sistemleri kurulmasında önemli bir engel selüloz ve hemiselüloz 1 enzimatik bozunma bulunmaktadır. Bitki ekspresyon sistemleri, bir endüstriyel ölçekte enzimlerin üretimi için büyük bir potansiyel göstermektedir. Onlar binlerce yıldır olduğu gibi hasat bitkilerin ekonomik ve hacim için Tarımsal sistemler zaten kurulmuş. Bitkilerdeki selülaz üretimi nedeniyle autohydrolysis 2'nin kolaylığı ve bitki hücre duvarlarının 1 sindirilebilirliğini arttırarak düşük enzim seviyeleri kullanımını maksimize etmek için potansiyeli gibi faktörler arzu edilir. Son olarak, bitki sistemleri, bitki hücrelerinin belirli alanlarda rekombinant proteinlerin hedefleme izin ve posttranslationally gereklidir 3 enzimleri değiştirmek edebiliyoruz.

"ve_content>

Nicotiana tabacum (tütün), çok yaygın olarak nedeniyle hızlı büyüme ve biyokütle birikiminin özelliklerine 4, bitkilerde heterolog protein ifade araştırmaları için bir model organizma olarak kullanılmaktadır. Rekombinant proteinlerin geçici ifadesi lokalizasyonuna olarak esnekliği ve böylece seçilen proteinler örneğin, selülazlar posttranslasyonel modifikasyonlar da, kısa zaman dilimleri 5 protein üretimini sağlayan bir tekniktir. Aynı zamanda, bitkilerde de sentezleme stratejileri için zemin ise bu, temel analiz için selülaz (ler) üretilmesini sağlar. Böyle bir strateji kullanarak geçici ifade, ev sahibi fungal Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) türetilen bir glikozil hidrolaz ailesi 5, Cel5A, 6 bir endoglukanaz (bundan sonra TrCel5A olarak anılacaktır) üretilir. TrCel5A doğal glikosile bir 42 kDa proteini olan ve hyd olarak oldukça aktiftirselüloz zincirler 7 roylzing.

Burada anlatılan teknik, geçici ifade, bitki Agrobacteria uygun bir ekspresyon vektörü içinde, ilgi konusu geni taşıyan ile yaprakların süzülmesiyle, nispeten yaygın olarak kullanılan sistemine dayanır. Planta ifade başarılı hızlı analizi için izin vermek için, TrCel5A da mCherry, orjinal Discosoma sp türetilmiş bir monomerik floresan proteini ile bir füzyon proteini olarak ifade edilebilir. Protein birleşik bir ek altı Histidin artığı (His-tag) ile, 8, DsRed C-terminali (TrCel5A mCherry). Heterolog füzyon proteini, TrCel5A-mCherry, böylece sentezlenmesi MCherry dağılımı incelemek için yeşil ışık kullanarak büyüyen bitki içinde izlenebilir. Eğer arzu edilirse, bitki malzemesinin ince kesitler proteinin belirli bir yeri oluşturmak için mikroskobik olarak yeşil ışık altında incelenebilir. Bu çalışma, sinyal ve tran içinoturmak peptidler, endoplazmik retikulum 9, heterolog protein ihracat yerleştirmek üzere, yapı içinde yer almıştır.

Selülaz aktivite testleri bir dizi çalıştırılabilir TrCel5A içeren bitki ifade selulazlann, etkinliğini analiz etmek. Toplam çözünür bitki proteinlerinin ekstre etmeden sonra, TrCel5A kısmen bir ısıda inkübasyon teknikle saflaştırılabilir. Protein boyutu Western blotting ile ve ardından SDS-PAGE ile kurulur. Çözünürlük 10: (CMC karboksimetil selüloz hale getirmek) Zymography alt-tabakalar, karboksi-metile edilmiş, örneğin selüloz karşı aktivitesini analiz etmek için kullanılabilir. Selülaz ve glukosidaz aktivitesi (4-MUC birleştirilmiş) β-D-sellobiyosid ilişkili fluorofor 4-metilumbelliferil-(4-MU) kullanılarak izlenebilir. Endoglukanaz etkinliğini değerlendirmek için başka bir yöntem, bir azo-d ile ilişkilendirilmiştir CMC spektrometrik analiz gerektirirye (Remazolbrilliant Mavi R) 11. Buna ek olarak, endoglukanaz ve selülazların bir dizi hem de protein aktivitesi, p-hidroksi benzoik asit hidrazid (PAHBAH) deneyi 12 gibi bir şeker analizi testinin kullanımı ile kontrol edilebilir. Bu teknikler ilgi ifade selülaz aktivitesini aydınlatmak ve ölçmek için kullanılabilir.

Protocol

Vahşi tipli N. tabacum Bitkiler 1. Büyüme N. büyümek tabacum'un L. cv. Toprak Petit Havana SR1 bitkiler, çimlenme için, normal saksı toprağı ile doldurulmuş uygun saksılara tütün tohumları yerleştirin. 2 hafta sonra, ayrı saksılara fidan aktarın. Sabit 22 ° C (karanlık dönemi) ya da 25 ° C (ışık periyodu) ile bir sera içinde bitkiler ve% 70 nispi hava nemi inkübe edin. 16/8 saat aydınlık / karanlık döngüsü aydınlatma sağlamak (örneğin</e…

Representative Results

TrCel5A ve TrCel5A mCherry geçici ekspresyon sistemi (Şekil 1A ve 1B) kullanılarak başarılı bir şekilde tütün bitkilerinde ifade edildi. TrCel5A mCherry füzyon proteininin ifade deseninin incelenmesi sağlıklı yaprakları yeşil ışık (Şekil 1D) altında yaygın bir protein ekspresyonu gösterdi (Şekil 1 C) ortaya çıkardı. Toplam çözünür proteinlerin çıkarımı ihtiva yaprağı vardı tütün bitkile…

Discussion

Selülazlann Rekombinant ifadesi nedeniyle daha verimli biyoyakıt üretim sistemleri 1 için arzu, büyük ilgi alanıdır. Bitkiler, ekonomik hasat teknikleri ve büyük ölçekli biyoyakıt üretimi için çok cazip özellikleri olan autohydrolysis yöntemleri gibi özellikleri ile başarılı selülaz üretimi için pek çok olanak sunuyor. Ayrıca, proteinlerin üretilmesi için farklı lokalizasyonu kullanımı, gerekirse, translasyon sonrası modifikasyonlar 20 izin verir. Belirgin avantajla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Bmbf Forschungsinitiative tarafından desteklenen "BioEnergie 2021 – Forschung für nutzung von BIOMASSE ölmek" ve bilimi teşvik etmek için Alman federal ve eyalet hükümetleri tarafından Mükemmellik Girişimi aracılığıyla finanse edilmektedir Mükemmellik "Biyokütle den Tailor-made Yakıtlar", bir küme ve Alman üniversitelerinde araştırma.

Materials

4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside SIGMA-ALDRICH M6018
Acetic acid ROTH 3738
Acetosyringon (concentrated) ROTH 6003
Antibiotic – kanamycin ROTH T832
Antibiotic – rifampicin ROTH 4163
Antibiotic – carbenicillin ROTH 6344
Antibody – rabbit anti His(6) pAb ROCKLAND 600-401-382
Antibody – goat anti rabbit AP, FC pAb DIANOVA 111-055-008
Azo-carboxymethyl cellulose MEGAZYME S-ACMC
β-cyclodextrin SIGMA-ALDRICH C4805
Calcium chloride dihydrate SIGMA-ALDRICH C5080
Carboxymethyl cellulose ROTH 3333.1
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 SIGMA-ALDRICH C2730
Congo red SIGMA-ALDRICH 75768
Coomasie brilliant blue G 250 ROTH 9598.2
D(+)-glucose ROTH 8337
Ethanol ROTH K928
Filter paper – Rotilabo blotting paper ROTH CL67
NBT/BCIP SIGMA-ALDRICH 72091
MES buffer ROTH 4256
Methanol ROTH 8388
Sodium citrate ROTH 3580
Sodium dodecylsulfate SERVA 20765
Sodium hydroxide ROTH 6771
Soil, Einheitserde classic  PATZER GMBH
Spectrometer – Infinite M200 TECAN
Sucrose SIGMA-ALDRICH S-5390
4-Hydroxy benzhydrazide  SIGMA-ALDRICH H9882
Phosphate buffered saline ROTH 1058
UV light source – BLAK RAY UVP
Vibratome – VT1000S Leica

References

  1. Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
  2. Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development. Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).
  3. Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion. Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).
  4. Sharma, A. K., Sharma, M. K. Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities. Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).
  5. Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins. Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).
  6. Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A. Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).
  7. Saloheimo, M., et al. EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme. Gene. 63, 11-21 (1988).
  8. Davidson, M. W., Campbell, R. E. Engineered fluorescent proteins: innovations and applications. Nature Methods. 6, 713-717 (2009).
  9. Pelham, H. R. The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum. Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).
  10. Béguin, P. Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas. Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).
  11. Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides. Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).
  12. Lever, M. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).
  13. Maclean, J., et al. Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).
  14. Munro, S., Pelham, H. R. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell. 48, 899-907 (1987).
  15. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  16. Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
  17. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets – procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
  18. Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).
  19. Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).
  20. Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).
  21. Sammond, D. W., et al. Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation. PLoS One. 7, (2012).
  22. Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O’Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica. Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).

Play Video

Cite This Article
Garvey, M., Klinger, J., Klose, H., Fischer, R., Commandeur, U. Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants. J. Vis. Exp. (88), e51711, doi:10.3791/51711 (2014).

View Video