Summary

Expression de recombinant cellulase Cel5A de<em> Trichoderma reesei</em> Dans les usines de tabac

Published: June 13, 2014
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Summary

Des plants de tabac ont été utilisés pour produire une cellulase fongique, TrCel5A, par l'intermédiaire d'un système d'expression transitoire. L'expression peut être contrôlée en utilisant une protéine de fusion fluorescente, et l'activité de la protéine a été caractérisée post-expression.

Abstract

Enzymes cellulose dégradantes, des cellulases, sont des cibles de la recherche et les intérêts industriels. La prépondérance de ces enzymes dans les organismes difficiles-à la culture, tels que les champignons de renforcement des hyphes et des bactéries anaérobies, a accéléré l'utilisation des technologies recombinantes dans ce domaine. Modes d'expression de plantes sont souhaitables pour un système de production à grande échelle d'enzymes et d'autres protéines utiles industriellement. Le présent mémoire, des procédés pour l'expression transitoire d'une endoglucanase fongique Trichoderma reesei Cel5A, dans Nicotiana tabacum sont démontrées. Expression de la protéine réussie est signalée, surveillée par fluorescence en utilisant une protéine de fusion mCherry-enzyme. En outre, un ensemble de tests de base sont utilisés pour examiner l'activité de T. transitoirement exprimé Cel5A reesei, y compris SDS-PAGE, Western blot, zymographie, ainsi que les dosages de fluorescence et de substrats de dégradation à base de colorant. Le système décrit ici peut être utilisé pour produire une cellule activeULASE dans une courte période de temps, afin d'évaluer le potentiel de production dans les usines à travers des systèmes d'expression constitutifs ou inductibles.

Introduction

La dégradation de la biomasse lignocellulosique et sa transformation en combustible liquide a été envisagée comme une méthode pour réduire la dépendance aux combustibles fossiles. Un obstacle important dans l'établissement de systèmes économiquement viables de transformation de la biomasse est dans la dégradation enzymatique de la cellulose et de l'hémicellulose 1. systèmes d'expression de plantes montrent un grand potentiel pour la production d'enzymes à l'échelle industrielle. Les systèmes agricoles à récolter des plantes économiquement et de volume sont déjà établis, comme ils l'ont été pendant des milliers d'années. La production de cellulases dans des plantes est souhaitable en raison de facteurs tels que la facilité d'auto-hydrolyse 2, et la possibilité d'optimiser l'utilisation des taux d'enzymes plus faibles en augmentant la digestibilité des parois cellulaires végétales 1. Enfin, les systèmes de plantes permettent le ciblage des protéines recombinantes à des zones spécifiques des cellules végétales et sont capables de modifier post-traductionnelle des enzymes le cas échéant 3.

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Nicotiana tabacum (tabac) est très couramment utilisé comme organisme modèle pour les études d'expression de protéines hétérologues dans les plantes, en raison de ses fonctions rapides d'accumulation croissance et la biomasse 4. L'expression transitoire de protéines recombinantes est une technique qui permet la production de protéines dans de courtes périodes de temps 5, tout en conservant une flexibilité quant à la localisation, et donc des modifications post-traductionnelles des protéines choisies à savoir, les cellulases. Cela permet la production de la cellulase (s) pour l'analyse de base, tout en jetant les bases de nouvelles stratégies d'expression dans les plantes. En utilisant cette stratégie d'expression transitoire, une endoglucanase à partir de la famille glycosyl hydrolase 5, Cel5A, dérivée de l'hôte fongique Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) 6 est produit (ci-après dénommé TrCel5A). TrCel5A est une protéine de 42 kDa qui est nativement glycosylée et est très actif dans hydroylzing chaînes de cellulose 7.

La technique d'expression transitoire décrit ici est basé sur un système relativement couramment utilisés, infiltrant les feuilles de la plante avec des agrobactéries portant le gène d'intérêt dans un vecteur d'expression approprié. Afin de permettre une analyse rapide de la réussite de l'expression in planta, TrCel5A peut également être exprimée en tant que protéine de fusion avec mCherry, une protéine fluorescente monomère initialement extraite de Discosoma sp. Protéine DsRed 8, avec un six résidus histidine supplémentaires (His-tag) fusionné à l'extrémité C-terminale (TrCel5A-mCherry). L'expression de la protéine de fusion hétérologue, TrCel5A-mCherry, peut donc être contrôlée dans la plante en croissance en utilisant la lumière verte à examiner mCherry dispersion. Si on le désire, des coupes minces de la matière végétale peut être examinée au microscope sous une lumière verte pour établir la localisation spécifique de la protéine. Pour ce travail, le signal et trans'asseoir peptides ont été incorporés dans la construction, pour localiser l'exportation de protéines hétérologues à le réticulum endoplasmique 9.

Pour analyser l'activité des cellulases végétaux exprimés, y compris TrCel5A, un certain nombre de tests d'activité de cellulase peut être exécuté. Après l'extraction des protéines totales solubles dans des plantes, TrCel5A peut être purifié en partie en utilisant une technique d'incubation thermique. la taille de la protéine est établi en utilisant SDS-PAGE suivi d'un Western blot. Zymographie peut être utilisée pour analyser l'activité contre les substrats, par exemple la cellulose qui a été carboxy-méthylé (fabrication de la carboxyméthylcellulose CMC): pour la solubilité 10. Cellulase et glucosidase peut être contrôlée en utilisant le fluorophore 4 méthylumbelliféryl (4-MU) associé à β-D-cellobioside (combiné: 4-MUC). Un autre procédé pour évaluer l'activité d'endoglucanase comprend l'analyse par spectrométrie de CMC qui a été associée à un azo-dvous (Remazolbrilliant Blue R) 11. En outre, l'activité des protéines de deux endoglucanases et une gamme de cellulases peut être contrôlée par l'utilisation d'un test d'analyse de sucre, tel que l'hydrazide de p-hydroxy benzoïque (PAHBAH) dosage 12. Ces techniques peuvent être utilisées pour élucider et de quantifier l'activité de la cellulase d'intérêt exprimée.

Protocol

1. Croissance de type sauvage N. tabacum plantes Pour grandir N. tabacum L. cv. Plantes Petit Havana SR1 sur le sol, placez les graines de tabac sur les pots appropriés remplis avec du terreau normal pour la germination. Après 2 semaines, transférer les plants dans des pots individuels. Incuber les plantes dans une serre avec une constante de 22 ° C (période sombre) ou 25 ° C (période de lumière) et 70% d'humidité relative de l'air. Fournir un éclairage dans un 16/8 h cycle…

Representative Results

TrCel5A et TrCel5A-mCherry ont été exprimés avec succès dans des plants de tabac en utilisant le système d'expression transitoire (figures 1A et 1B). L'examen du profil d'expression de la protéine de fusion TrCel5A-mCherry révélé feuilles saines (figure 1C), qui a montré l'expression de protéines sous une lumière verte généralisée (figure 1D). Extraction des protéines solubles totales a été …

Discussion

L'expression recombinante de cellulases est un domaine de grand intérêt, en raison de la volonté de plus efficaces les systèmes de production de biocarburants 1. Plantes offrent de nombreuses possibilités pour la réussite de la production de cellulases, avec des fonctionnalités telles que les techniques de récolte économique et les méthodes de autohydrolyse étant des propriétés très souhaitables pour la production de biocarburants à grande échelle. En outre, l'utilisation de différent…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le BMBF Forschungsinitiative "BioEnergie 2021 – Forschung für die Nutzung von Biomasse" et le pôle d'excellence "carburants sur mesure à partir de la biomasse", qui est financé par l'Initiative d'excellence par les gouvernements fédéral et de l'Etat allemand pour promouvoir la science et de la recherche dans les universités allemandes.

Materials

4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside SIGMA-ALDRICH M6018
Acetic acid ROTH 3738
Acetosyringon (concentrated) ROTH 6003
Antibiotic – kanamycin ROTH T832
Antibiotic – rifampicin ROTH 4163
Antibiotic – carbenicillin ROTH 6344
Antibody – rabbit anti His(6) pAb ROCKLAND 600-401-382
Antibody – goat anti rabbit AP, FC pAb DIANOVA 111-055-008
Azo-carboxymethyl cellulose MEGAZYME S-ACMC
β-cyclodextrin SIGMA-ALDRICH C4805
Calcium chloride dihydrate SIGMA-ALDRICH C5080
Carboxymethyl cellulose ROTH 3333.1
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 SIGMA-ALDRICH C2730
Congo red SIGMA-ALDRICH 75768
Coomasie brilliant blue G 250 ROTH 9598.2
D(+)-glucose ROTH 8337
Ethanol ROTH K928
Filter paper – Rotilabo blotting paper ROTH CL67
NBT/BCIP SIGMA-ALDRICH 72091
MES buffer ROTH 4256
Methanol ROTH 8388
Sodium citrate ROTH 3580
Sodium dodecylsulfate SERVA 20765
Sodium hydroxide ROTH 6771
Soil, Einheitserde classic  PATZER GMBH
Spectrometer – Infinite M200 TECAN
Sucrose SIGMA-ALDRICH S-5390
4-Hydroxy benzhydrazide  SIGMA-ALDRICH H9882
Phosphate buffered saline ROTH 1058
UV light source – BLAK RAY UVP
Vibratome – VT1000S Leica

References

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Garvey, M., Klinger, J., Klose, H., Fischer, R., Commandeur, U. Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants. J. Vis. Exp. (88), e51711, doi:10.3791/51711 (2014).

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