Expression de recombinant cellulase Cel5A de<em> Trichoderma reesei</em> Dans les usines de tabac
Summary
Des plants de tabac ont été utilisés pour produire une cellulase fongique, TrCel5A, par l'intermédiaire d'un système d'expression transitoire. L'expression peut être contrôlée en utilisant une protéine de fusion fluorescente, et l'activité de la protéine a été caractérisée post-expression.
Abstract
Enzymes cellulose dégradantes, des cellulases, sont des cibles de la recherche et les intérêts industriels. La prépondérance de ces enzymes dans les organismes difficiles-à la culture, tels que les champignons de renforcement des hyphes et des bactéries anaérobies, a accéléré l'utilisation des technologies recombinantes dans ce domaine. Modes d'expression de plantes sont souhaitables pour un système de production à grande échelle d'enzymes et d'autres protéines utiles industriellement. Le présent mémoire, des procédés pour l'expression transitoire d'une endoglucanase fongique Trichoderma reesei Cel5A, dans Nicotiana tabacum sont démontrées. Expression de la protéine réussie est signalée, surveillée par fluorescence en utilisant une protéine de fusion mCherry-enzyme. En outre, un ensemble de tests de base sont utilisés pour examiner l'activité de T. transitoirement exprimé Cel5A reesei, y compris SDS-PAGE, Western blot, zymographie, ainsi que les dosages de fluorescence et de substrats de dégradation à base de colorant. Le système décrit ici peut être utilisé pour produire une cellule activeULASE dans une courte période de temps, afin d'évaluer le potentiel de production dans les usines à travers des systèmes d'expression constitutifs ou inductibles.
Introduction
La dégradation de la biomasse lignocellulosique et sa transformation en combustible liquide a été envisagée comme une méthode pour réduire la dépendance aux combustibles fossiles. Un obstacle important dans l'établissement de systèmes économiquement viables de transformation de la biomasse est dans la dégradation enzymatique de la cellulose et de l'hémicellulose 1. systèmes d'expression de plantes montrent un grand potentiel pour la production d'enzymes à l'échelle industrielle. Les systèmes agricoles à récolter des plantes économiquement et de volume sont déjà établis, comme ils l'ont été pendant des milliers d'années. La production de cellulases dans des plantes est souhaitable en raison de facteurs tels que la facilité d'auto-hydrolyse 2, et la possibilité d'optimiser l'utilisation des taux d'enzymes plus faibles en augmentant la digestibilité des parois cellulaires végétales 1. Enfin, les systèmes de plantes permettent le ciblage des protéines recombinantes à des zones spécifiques des cellules végétales et sont capables de modifier post-traductionnelle des enzymes le cas échéant 3.
ve_content ">Nicotiana tabacum (tabac) est très couramment utilisé comme organisme modèle pour les études d'expression de protéines hétérologues dans les plantes, en raison de ses fonctions rapides d'accumulation croissance et la biomasse 4. L'expression transitoire de protéines recombinantes est une technique qui permet la production de protéines dans de courtes périodes de temps 5, tout en conservant une flexibilité quant à la localisation, et donc des modifications post-traductionnelles des protéines choisies à savoir, les cellulases. Cela permet la production de la cellulase (s) pour l'analyse de base, tout en jetant les bases de nouvelles stratégies d'expression dans les plantes. En utilisant cette stratégie d'expression transitoire, une endoglucanase à partir de la famille glycosyl hydrolase 5, Cel5A, dérivée de l'hôte fongique Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) 6 est produit (ci-après dénommé TrCel5A). TrCel5A est une protéine de 42 kDa qui est nativement glycosylée et est très actif dans hydroylzing chaînes de cellulose 7.
La technique d'expression transitoire décrit ici est basé sur un système relativement couramment utilisés, infiltrant les feuilles de la plante avec des agrobactéries portant le gène d'intérêt dans un vecteur d'expression approprié. Afin de permettre une analyse rapide de la réussite de l'expression in planta, TrCel5A peut également être exprimée en tant que protéine de fusion avec mCherry, une protéine fluorescente monomère initialement extraite de Discosoma sp. Protéine DsRed 8, avec un six résidus histidine supplémentaires (His-tag) fusionné à l'extrémité C-terminale (TrCel5A-mCherry). L'expression de la protéine de fusion hétérologue, TrCel5A-mCherry, peut donc être contrôlée dans la plante en croissance en utilisant la lumière verte à examiner mCherry dispersion. Si on le désire, des coupes minces de la matière végétale peut être examinée au microscope sous une lumière verte pour établir la localisation spécifique de la protéine. Pour ce travail, le signal et trans'asseoir peptides ont été incorporés dans la construction, pour localiser l'exportation de protéines hétérologues à le réticulum endoplasmique 9.
Pour analyser l'activité des cellulases végétaux exprimés, y compris TrCel5A, un certain nombre de tests d'activité de cellulase peut être exécuté. Après l'extraction des protéines totales solubles dans des plantes, TrCel5A peut être purifié en partie en utilisant une technique d'incubation thermique. la taille de la protéine est établi en utilisant SDS-PAGE suivi d'un Western blot. Zymographie peut être utilisée pour analyser l'activité contre les substrats, par exemple la cellulose qui a été carboxy-méthylé (fabrication de la carboxyméthylcellulose CMC): pour la solubilité 10. Cellulase et glucosidase peut être contrôlée en utilisant le fluorophore 4 méthylumbelliféryl (4-MU) associé à β-D-cellobioside (combiné: 4-MUC). Un autre procédé pour évaluer l'activité d'endoglucanase comprend l'analyse par spectrométrie de CMC qui a été associée à un azo-dvous (Remazolbrilliant Blue R) 11. En outre, l'activité des protéines de deux endoglucanases et une gamme de cellulases peut être contrôlée par l'utilisation d'un test d'analyse de sucre, tel que l'hydrazide de p-hydroxy benzoïque (PAHBAH) dosage 12. Ces techniques peuvent être utilisées pour élucider et de quantifier l'activité de la cellulase d'intérêt exprimée.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'expression recombinante de cellulases est un domaine de grand intérêt, en raison de la volonté de plus efficaces les systèmes de production de biocarburants 1. Plantes offrent de nombreuses possibilités pour la réussite de la production de cellulases, avec des fonctionnalités telles que les techniques de récolte économique et les méthodes de autohydrolyse étant des propriétés très souhaitables pour la production de biocarburants à grande échelle. En outre, l'utilisation de différent…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le BMBF Forschungsinitiative "BioEnergie 2021 – Forschung für die Nutzung von Biomasse" et le pôle d'excellence "carburants sur mesure à partir de la biomasse", qui est financé par l'Initiative d'excellence par les gouvernements fédéral et de l'Etat allemand pour promouvoir la science et de la recherche dans les universités allemandes.
Materials
| 4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside | SIGMA-ALDRICH | M6018 | |
| Acetic acid | ROTH | 3738 | |
| Acetosyringon (concentrated) | ROTH | 6003 | |
| Antibiotic – kanamycin | ROTH | T832 | |
| Antibiotic – rifampicin | ROTH | 4163 | |
| Antibiotic – carbenicillin | ROTH | 6344 | |
| Antibody – rabbit anti His(6) pAb | ROCKLAND | 600-401-382 | |
| Antibody – goat anti rabbit AP, FC pAb | DIANOVA | 111-055-008 | |
| Azo-carboxymethyl cellulose | MEGAZYME | S-ACMC | |
| β-cyclodextrin | SIGMA-ALDRICH | C4805 | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA-ALDRICH | C5080 | |
| Carboxymethyl cellulose | ROTH | 3333.1 | |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | SIGMA-ALDRICH | C2730 | |
| Congo red | SIGMA-ALDRICH | 75768 | |
| Coomasie brilliant blue G 250 | ROTH | 9598.2 | |
| D(+)-glucose | ROTH | 8337 | |
| Ethanol | ROTH | K928 | |
| Filter paper – Rotilabo blotting paper | ROTH | CL67 | |
| NBT/BCIP | SIGMA-ALDRICH | 72091 | |
| MES buffer | ROTH | 4256 | |
| Methanol | ROTH | 8388 | |
| Sodium citrate | ROTH | 3580 | |
| Sodium dodecylsulfate | SERVA | 20765 | |
| Sodium hydroxide | ROTH | 6771 | |
| Soil, Einheitserde classic | PATZER GMBH | ||
| Spectrometer – Infinite M200 | TECAN | ||
| Sucrose | SIGMA-ALDRICH | S-5390 | |
| 4-Hydroxy benzhydrazide | SIGMA-ALDRICH | H9882 | |
| Phosphate buffered saline | ROTH | 1058 | |
| UV light source – BLAK RAY | UVP | ||
| Vibratome – VT1000S | Leica |
References
- Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
- Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development. Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).
- Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion. Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).
- Sharma, A. K., Sharma, M. K. Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities. Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).
- Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins. Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).
- Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A. Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).
- Saloheimo, M., et al. EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme. Gene. 63, 11-21 (1988).
- Davidson, M. W., Campbell, R. E. Engineered fluorescent proteins: innovations and applications. Nature Methods. 6, 713-717 (2009).
- Pelham, H. R. The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum. Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).
- Béguin, P. Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas. Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).
- Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides. Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).
- Lever, M. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).
- Maclean, J., et al. Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).
- Munro, S., Pelham, H. R. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell. 48, 899-907 (1987).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets – procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).
- Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).
- Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).
- Sammond, D. W., et al. Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation. PLoS One. 7, (2012).
- Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O’Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica. Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).
