Espressione ricombinante Cellulase Cel5A da<em> Trichoderma reesei</em> In piante di tabacco
Summary
Piante di tabacco sono stati usati per produrre una cellulasi fungine, TrCel5A, tramite un sistema di espressione transiente. L'espressione potrebbe essere monitorato utilizzando una proteina di fusione fluorescente, e l'attività della proteina è stata caratterizzata post-espressione.
Abstract
Enzimi degradanti Cellulosa, cellulasi, sono obiettivi sia di ricerca e di interessi industriali. La preponderanza di questi enzimi in-a-cultura difficili organismi, come funghi ife costruzione e batteri anaerobici, ha accelerato l'uso di tecnologie ricombinanti in questo campo. Metodi di espressione pianta sono un sistema desiderabile per la produzione su larga scala di enzimi e altre proteine industrialmente utili. Qui, sono dimostrati metodi per l'espressione transitoria di un endoglucanasi fungina, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum. Espressione della proteina successo è mostrato, monitorato mediante fluorescenza utilizzando una proteina di fusione mCherry-enzima. Inoltre, una serie di test di base sono utilizzati per esaminare l'attività di transitoriamente espresso T. reesei Cel5A, compresi SDS-PAGE, Western blotting, zimografia, nonché fluorescenza e substrato saggi degradazione dye. Il sistema qui descritto può essere usato per produrre una cella attivaulase in un breve periodo di tempo, in modo da valutare il potenziale di ulteriore produzione in impianti attraverso sistemi di espressione costitutiva o inducibile.
Introduction
La degradazione della biomassa lignocellulosica e la sua conversione in combustibile liquido è stato immaginato come un metodo per ridurre la dipendenza dai combustibili fossili. Un ostacolo importante nella realizzazione di sistemi di elaborazione biomassa economicamente realizzabili è nella degradazione enzimatica della cellulosa ed emicellulosa 1. Sistemi di espressione vegetali mostrano un grande potenziale per la produzione di enzimi su scala industriale. Sistemi agricoli ad impianti di raccolta economicamente e di volume sono già stabiliti, come lo sono stati per migliaia di anni. La produzione di cellulasi in piante è desiderabile a causa di fattori come la facilità di autohydrolysis 2, e la possibilità di massimizzare l'uso degli enzimi inferiori aumentando la digeribilità delle pareti cellulari vegetali 1. Infine, sistemi vegetali consentono il targeting di proteine ricombinanti ad aree specifiche di cellule vegetali e sono in grado di modificare posttranslationally enzimi ove richiesto 3.
ve_content ">Nicotiana tabacum (tabacco) è molto comunemente usato come organismo modello per studi di espressione di proteine eterologhe in piante, a causa della sua crescita e biomassa rapidi caratteristiche di accumulo 4. Espressione transiente di proteine ricombinanti è una tecnica che permette la produzione di proteine in brevi periodi di tempo 5, pur mantenendo la flessibilità nella localizzazione e quindi modificazioni post-traduzionali delle proteine selezionate, cioè cellulasi. Ciò consente la produzione di cellulasi (s) per analisi di base, ponendo contemporaneamente le basi per ulteriori strategie di espressione in piante. Utilizzando tale strategia espressione transitoria, un'endoglucanasi da glicosil idrolasi famiglia 5, Cel5A, derivato dal ospitante fungina Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) 6 è prodotta (di seguito denominato TrCel5A). TrCel5A è una proteina di kDa 42 che è nativo glicosilata ed è molto attivo in HYDroylzing catene di cellulosa 7.
La tecnica espressione transiente qui descritto è basato su un sistema relativamente comunemente usato, infiltrando la pianta lascia con Agrobacteria porta il gene di interesse in un vettore di espressione appropriato. Per consentire una rapida analisi di successo nell'espressione planta, TrCel5A può anche essere espresso come proteina di fusione con mCherry, una proteina fluorescente monomerica originariamente derivato da Discosoma sp. Proteine DsRed 8, con l'aggiunta di sei residui di istidina (His-tag) fusi a il C-terminale (TrCel5A-mCherry). L'espressione della proteina di fusione eterologa, TrCel5A-mCherry, può quindi essere monitorato all'interno della pianta che cresce utilizzando luce verde per esaminare mCherry dispersione. Se lo si desidera, sezioni sottili di materiale vegetale può essere esaminato sotto luce verde al microscopio per stabilire la localizzazione specifica della proteina. Per questo lavoro, segnale e transit peptidi sono stati incorporati nel costrutto, di localizzare la proteina eterologa esportazione verso il reticolo endoplasmatico 9.
Per analizzare l'attività di cellulasi vegetali espresse, compreso TrCel5A, una serie di prove di attività cellulasi può essere eseguito. Dopo l'estrazione del totale delle proteine vegetali solubili, TrCel5A può essere parzialmente purificato utilizzando una tecnica di incubazione termica. Dimensione proteina viene stabilita tramite SDS-PAGE seguita da Western blotting. Zimografia può essere utilizzato per analizzare l'attività contro substrati, ad esempio cellulosa che è stato carbossi-metilato (rendendo carbossimetil cellulosa: CMC) per solubilità 10. Attività cellulasi e glucosidasi può essere monitorato utilizzando il fluoroforo 4-metilumbelliferil (4-MU) associata a β-D-cellobioside (combinato: 4-MUC). Un altro metodo per valutare l'attività di endoglucanasi prevede l'analisi spettrometrica di CMC che è stata associata con un azo-dye (Remazolbrilliant Blu R) 11. Inoltre, l'attività della proteina di entrambi endoglucanasi e una gamma di cellulasi può essere monitorato mediante l'uso di un test di analisi zucchero, come l'idrazide p-idrossi benzoico (PAHBAH) saggio 12. Queste tecniche possono essere utilizzate per chiarire e quantificare l'attività della cellulasi espressa di interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Espressione ricombinante di cellulasi è un campo di grande interesse, a causa del desiderio di più efficienti sistemi di produzione di biocarburanti 1. Le piante offrono molte possibilità per la produzione di cellulasi successo, con caratteristiche come le tecniche di raccolta economica e metodi autohydrolysis essendo proprietà molto desiderabili per la produzione di biocarburanti su larga scala. Inoltre, l'uso di diverse localizzazioni per la produzione di proteine consentire, se necessario, mo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal BMBF Forschungsinitiative "BioEnergie 2021 – Forschung für die Nutzung von Biomasse" e il Cluster di eccellenza "Combustibili su misura da biomassa", che è finanziato attraverso l'iniziativa di eccellenza da parte dei governi federali e statali tedesche per promuovere la scienza e di ricerca presso università tedesche.
Materials
| 4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside | SIGMA-ALDRICH | M6018 | |
| Acetic acid | ROTH | 3738 | |
| Acetosyringon (concentrated) | ROTH | 6003 | |
| Antibiotic – kanamycin | ROTH | T832 | |
| Antibiotic – rifampicin | ROTH | 4163 | |
| Antibiotic – carbenicillin | ROTH | 6344 | |
| Antibody – rabbit anti His(6) pAb | ROCKLAND | 600-401-382 | |
| Antibody – goat anti rabbit AP, FC pAb | DIANOVA | 111-055-008 | |
| Azo-carboxymethyl cellulose | MEGAZYME | S-ACMC | |
| β-cyclodextrin | SIGMA-ALDRICH | C4805 | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA-ALDRICH | C5080 | |
| Carboxymethyl cellulose | ROTH | 3333.1 | |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | SIGMA-ALDRICH | C2730 | |
| Congo red | SIGMA-ALDRICH | 75768 | |
| Coomasie brilliant blue G 250 | ROTH | 9598.2 | |
| D(+)-glucose | ROTH | 8337 | |
| Ethanol | ROTH | K928 | |
| Filter paper – Rotilabo blotting paper | ROTH | CL67 | |
| NBT/BCIP | SIGMA-ALDRICH | 72091 | |
| MES buffer | ROTH | 4256 | |
| Methanol | ROTH | 8388 | |
| Sodium citrate | ROTH | 3580 | |
| Sodium dodecylsulfate | SERVA | 20765 | |
| Sodium hydroxide | ROTH | 6771 | |
| Soil, Einheitserde classic | PATZER GMBH | ||
| Spectrometer – Infinite M200 | TECAN | ||
| Sucrose | SIGMA-ALDRICH | S-5390 | |
| 4-Hydroxy benzhydrazide | SIGMA-ALDRICH | H9882 | |
| Phosphate buffered saline | ROTH | 1058 | |
| UV light source – BLAK RAY | UVP | ||
| Vibratome – VT1000S | Leica |
References
- Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
- Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development. Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).
- Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion. Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).
- Sharma, A. K., Sharma, M. K. Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities. Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).
- Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins. Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).
- Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A. Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).
- Saloheimo, M., et al. EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme. Gene. 63, 11-21 (1988).
- Davidson, M. W., Campbell, R. E. Engineered fluorescent proteins: innovations and applications. Nature Methods. 6, 713-717 (2009).
- Pelham, H. R. The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum. Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).
- Béguin, P. Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas. Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).
- Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides. Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).
- Lever, M. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).
- Maclean, J., et al. Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).
- Munro, S., Pelham, H. R. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell. 48, 899-907 (1987).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets – procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).
- Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).
- Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).
- Sammond, D. W., et al. Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation. PLoS One. 7, (2012).
- Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O’Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica. Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).
