High-throughput Immagine Analisi di sferoidi tumorali: Un software applicativo di facile utilizzo per misurare le dimensioni del Spheroids automaticamente e con precisione

SpheroidSizer è progettato per produrre rilevamento automatico, definizione e misurazione degli sferoidi 3D, con una notevole riduzione di lavoro e acutamente maggiore efficienza per grandi quantità di immagini. Figura 1A mostra il flusso di lavoro di SpheroidSizer. I passi fondamentali di calcolo comprendono l'inizializzazione automatico, l'algoritmo profilo attivo e contorno quantificazione. Dopo il calcolo automatico, la funzione di controllo di qualità utilizza una combinazione di "Initialize manuale" e strumenti "disegnare a mano" per salvare qualsiasi segmentazione imperfetto. Figura 1B illustra l'algoritmo profilo attivo automatizzato dettagliata. La fase di inizializzazione (iterazione 0 °) utilizza fasi di elaborazione delle immagini per generare dimensioni approssimative e la posizione dello sferoide e generare un contorno iniziazione sferico con una dimensione stimata. Il profilo iniziazione alimenta l'algoritmo profilo attivo. A sua volta si itera per regolare secondo l'immagine localegradiente e la forma di curvatura. L'algoritmo profilo attivo termina quando il contorno stabilizza (converge), vale a dire 477 iterazioni per questa immagine, oppure quando viene eseguito il numero massimo predefinito di iterazioni. In questo esempio, il profilo di inizializzazione è volutamente ingrandita per mostrare meglio l'algoritmo. In realtà, l'inizializzazione è di solito molto vicino al limite reale e molto meno iterazioni sono necessarie per l'algoritmo a convergere. Successivamente, l'algoritmo effettua misurazioni morfometriche del confine sferoide rilevato. Gli assi maggiore e minore della sferoide sono misurate utilizzando MATLAB toolbox di elaborazione delle immagini (Figura 1C). L'asse maggiore è definito come il segmento di linea che collega una coppia di punti più lontani sul profilo, che si riferisce alla lunghezza (L). L'asse minore è definita come la più lunga linea perpendicolare all'asse maggiore, che si riferisce alla larghezza (W). In questo caso, i valori di L e W sono molto vicine in quanto lasferoide è sferica. Il volume dello sferoide è calcolato come V = 0.5 * L * W 2. Una delle caratteristiche di SpheroidSizer è la sua rilevazione automatica del limite di sferoidi anche su immagini con sfondo uniforme o rumoroso utilizzando l'algoritmo profilo attivo (Figure 2B-D). Elaborazione computazionale delle immagini in campo chiaro è spesso afflitto da uno sfondo uniforme, che induca erroneamente metodi basati thresholding-adattativi per produrre risultati thresholding indesiderati. Il problema è particolarmente evidente quando piastre multi-pure vengono utilizzati e le pareti dei pozzetti possono creare effetti di ombreggiatura sulle immagini. Tuttavia, poiché l'algoritmo profilo attivo non è sensibile alla variazione ombreggiatura graduale in background, è in grado di identificare segmentazione sferoide in queste immagini in campo chiaro con una corretta inizializzazione. Figura 2 mostra alcuni esempi di immagini con sfondo uniforme o rumoroso, come irregolare illuminazione (Figura 2B </strong>), detriti (Figura 2C) o core necrotico (Figura 2D). Con algoritmo automatizzato profilo attivo, SpheroidSizer delinea questi sferoidi accuratamente in tutte queste immagini come mostrato nel contorno rosso al pannello inferiore di ciascuna figura. La funzione di controllo di qualità di SpheroidSizer è la chiave per un flusso di lavoro high-throughput. Il "Initialize Manual" e strumenti "disegnare a mano" sono gli strumenti gratuiti utili per questa applicazione. Tra centinaia o migliaia di immagini, è inevitabile che l'algoritmo automatico non è in grado di rilevare correttamente gli sferoidi in alcune immagini. Come illustrato nella Figura 3A, quando rilevamento errato dello sferoide è dovuta alla fase di inizializzazione, cioè formato improprio o posizione del profilo iniziazione nell'immagine (pannello superiore), l'utensile "Inizializza Manual" funziona consentendo all'utente di correttamente definire la posizione e le dimensioni del spherOID manualmente (pannello inferiore). Si innesca l'algoritmo contorno attiva per lanciare con profilo definito manualmente ed eseguire convergere sul contorno desiderato. Per queste immagini difficili come l'immagine originale in Figura 3B, sferoide si trova in uno sfondo di distrazione e rumoroso. SpheroidSizer non è in grado di identificare univocamente il sferoide dal metodo automatizzato (pannello superiore) o dalla funzione "Inizializzazione manuale" con una corretta inizializzazione (pannello centrale). In questo caso, lo strumento "Draw Mano" può essere utilizzato per estrarre manualmente il contorno dello sferoide come illustrato nel pannello inferiore. Il programma utilizza il limite definito dall'utente per misurare gli assi maggiore e minore del sferoide e calcolare il volume. Tutti i risultati corretti vengono immediatamente inseriti nella "tabella dei risultati", e possono essere di conseguenza esportate. Per determinare le prestazioni di SpheroidSizer in insiemi di dati di grandi dimensioni, ci confrontiamo prima volta operazioneAnalizzando lo stesso set di 288 immagini utilizzando uno) misurazioni manuali con il microscopio fornitore del software in dotazione; 2) SpheroidSizer con un single-core portatile normale; e 3) SpheroidSizer con un multi-core workstation prestazioni di calcolo parallelo. Le misurazioni manuali seguono il nostro protocollo tipico prima di sviluppare il software: la lunghezza e la larghezza di ogni sferoide sono disegnati a mano e valutate con il fornitore del programma (come si vede le linee rosse nel pannello superiore della figura 4A); poi l'utente copia stabilisce i valori di misurazione. SpheroidSizer elabora ogni immagine generando il confine sferoide (come mostrato il contorno rosso nel pannello inferiore della figura 4A), misurando la lunghezza maggiore e minore assiale, ed esportare i risultati in fogli di calcolo. Come si vede nella Tabella 1, basato sul calcolo di 288 immagini, ci vuole una media di 31.67 sec per misurare uno sferoide per immagine manualmente; mentre richiede solo SpheroidSizer meno di 2 sec & # 160, quando in esecuzione su un single-core portatile normale; e meno di 1 sec quando viene eseguito su una workstation prestazioni 12-core. Pertanto, l'analisi immagine è su 18x più veloce per un'immagine utilizzando SpheroidSizer di misurazioni manuali. Si riduce drasticamente il lavoro quando più di migliaia di immagini vengono analizzati. Avanti, mettiamo a confronto la variabilità nelle misurazioni delle 24 sferoidi illustrati nella Figura 4A tra le misure manuali e SpheroidSizer. Le 24 sferoidi sono misurati tre volte con entrambi i metodi; e la deviazione standard di ogni singolo sferoide viene calcolato. Come si vede nella Figura 4B, la deviazione standard dalla SpheroidSizer (linea verde e puntini) è vicino a zero, tranne per i tre sferoidi che vengono corretti nella fase di controllo di qualità, che mostrano ancora deviazione standard inferiore a quelli del metodo di misurazione manuale. Tutti questi indicano che SpheroidSizer esegue l'analisi dell'immagine più efficiente e preciso. e_content "> Abbiamo condotto uno schermo di droga utilizzando sferoidi BON-1 tumore 3D umani per scoprire quali composti in combinazione con un inibitore Hsp90 sono i potenziali candidati per testare gli effetti antitumorali in vivo. sferoidi tumorali BON-1 3D umani sono stati coltivati su piastre a 96 pozzetti agarosio rivestite come descritto nel precedente articolo 15. Otto diversi composti con sei diluizioni seriali più mezzi di comunicazione e veicolo sono stati selezionati per i loro effetti singoli e combinatori con 10 nM e 20 nM inibitore Hsp90 in duplicato, rispettivamente. due sferoidi sono stati utilizzati per ciascuna concentrazione della sostanza singola o composti combinati. stati usati quattro piastre da 96 pozzetti con totale 384 sferoidi. Tutti gli sferoidi sono stati ripresi a 0, 72, 144, 168, e 192 hr. Un totale di 1.920 immagini sono state prodotte da questo esperimento. Ci sono voluti SpheroidSizer solo 30 minuti per completare l'analisi computazionale dei 1.920 immagini con un ulteriore 50 min per il controllo di qualità e l'esportazione dei dati. SpheroidSizer accelera il processo di analisi di immagine enorme. figura 5A mostra una schermata del regime cartelle e nomi di file per questo esperimento come un esempio per Protocollo Fase 3.3. Figure 5B-E mostra le schermate delle finestre e dei risultati pop-up di analisi delle immagini . usando SpheroidSizer come illustrazioni per il protocollo Steps 4, 5, e 7 Prendendo i volumi dei sferoidi 3D dalla tabella dei risultati in formato esportato da SpheroidSizer, abbiamo fatto i grafici – la crescita di sferoidi tumorali 3D su trattamenti composti in funzione del tempo di trattamenti. Due grafici rappresentativi di questo esperimento sono mostrati in Figura 5F e 5G. Figura 5F mostra che i trattamenti combinati di inibitore Hsp90 e cladribina (linea verde) inibiscono la crescita di sferoidi 3D più che il singolo trattamento di inibitore Hsp90 (linea viola) o cladribina (linea arancione), suggerendo che i trattamenti combinati di inibitore Hsp90 e cladribina può avere anti-tumorale effetti in vivo. figura 5G mostra che i trattamenti combinati di inibitore Hsp90 e adriamicina (linea verde) non inibiscono la crescita di sferoidi 3D più che il singolo trattamento di adriamicina (linea arancione) o un inibitore Hsp90 (linea viola), suggerendo che il trattamenti combinati di inibitore Hsp90 e adriamicina non possono avere effetti anti-tumorali in vivo. Questo esperimento ci ha aiutato a meglio selezionare i composti per testare i loro effetti anti-tumorali in vivo e SpheroidSizer è la chiave per l'analisi dei dati sperimentali veloce. Tabella 1. Confronto tra tempo di funzionamento all'analisi dell'immagine tra misurazioni manuali e SpheroidSizer analizzando lo stesso insieme di 288 immagini. prega cleccare qui per vedere una versione più grande di questa tabella. Figura 1 SpheroidSizer -… Un'applicazione software open-source per misurare le dimensioni della sferoide A) Il flusso di lavoro nucleo dell'applicazione B) Illustrazione dell'algoritmo profilo attivo a diversi stadi di iterazione. Si prega di notare che il contorno di inizializzazione (iterazione 0) è stato appositamente ampliato al fine di mostrare l'algoritmo. C) i maggiori e minori misure di lunghezza assiale e calcolo del volume SpheroidSizer. L – asse maggiore: il segmento di linea che collega una coppia di punti più lontani sul profilo (cui lunghezza); W – asse minore: la linea più lunga perpendicolare all'asse maggiore (di cui larghezza). <p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figura 2. Risultati rappresentativi della segmentazione automatica di SpheroidSizer, mostrando la robustezza contro varie condizioni di immagine. A) immagini tipica di buona qualità. B) Immagini con luminosità e contrasto differente. C) Immagini con detriti di distrazione. D) Immagini di sferoidi con core necrotico . Le immagini del pannello superiore di ogni figura sono la fonte / immagini originali; immagini del pannello inferiore di ciascuna figura sono le immagini di controllo della qualità; e il contorno rosso è la segmentazione sferoide disegnata da calcolo automatizzato. hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51639/51639fig3.jpg "/> Figura 3. Illustrazione della "Initialize Manual" e "Disegna Hand" strumenti. A) Lo strumento "Manuale Initialize" consente il disegno di una forma di ellisse raccordo di tutti i sferoide per l'inizializzazione, quando si verifica la segmentazione sferoide impreciso dopo l'inizializzazione automatica. B ) Lo strumento "Hand Draw" consente disegno a mano precisa del confine sferoide, quando segmentazioni sferoidali imprecise si verificano con l'inizializzazione sia automatico che manuale. La linea blu intorno al sferoide mostra il profilo di inizializzazione; il contorno rosso è il confine sferoide identificato. Si prega di notare che la sferoide in "Initialize manuale" in A) e lo sferoide in "Draw Hand" in B) è volutamente ingrandita per mostrare meglio gli strumenti. <img alt="Figura 4" fo:coS copi-width = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/51639/51639fig4highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51639/51639fig4.jpg" /> Figura 4. Confronto delle prestazioni di analisi di immagine tra SpheroidSizer e misurazioni manuali analizzando lo stesso insieme di 24 immagini. A) sferoidi rappresentativi per mostrare come la lunghezza e la larghezza di sferoidi sono determinate con misure manuali e SpheroidSizer. Top 24 immagini contengono disegnati a mano lunghezza / larghezza di ogni sferoide in linee rosse con misurazioni manuali; minori di 24 immagini (le stesse 24 immagini) contengono computer disegnato sferoidale confine in contorno rosso con SpheroidSizer. B) Deviazione standard della lunghezza o larghezza da tre misurazioni su ogni singolo sferoide. Figura 5. Un esempio rappresentativo di utilizzazione SpheroidSizer in schermo di droga – analisi delle immagini sulle immagini degli sferoidi 'che sono stati raccolti da uno schermo di droga utilizzando sferoidi tumorali BON-1 3D A) Una schermata del regime cartelle e nomi di file per questo progetto B) Una schermata del avanzati.. finestra configurazioni in SpheroidSizer. C) Una schermata della finestra di SpheroidSizer1.0 con risultati visualizzati tabella. D) Una schermata del file di output in formato esportato da SpheroidSizer. E) una schermata del file di output elenco esportato da SpheroidSizer. F) La crescita di sferoidi tumorali 3D su i trattamenti con inibitori Hsp90 e la cladribina. G) ​​La crescita di sferoidi tumorali 3D su i trattamenti con inibitori Hsp90 e adriamicina. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. </ P>