De alta capacidade Análise de Imagem de esferóides tumorais: uma aplicação de software de fácil utilização para medir o tamanho de esferóides automaticamente e com precisão

SpheroidSizer é projetada para produzir detecção automática, delimitação e mensuração dos esferóides 3D, com mão de obra extremamente reduzida e de forma aguda o aumento da eficiência para grandes quantidades de imagens. Figura 1A mostra o fluxo de trabalho de SpheroidSizer. Os passos básicos de computação incluem inicialização automática, o algoritmo de contorno ativo e contorno quantificação. Após automatizado de computação, o recurso de controle de qualidade utiliza uma combinação de "Inicializar Manual" e ferramentas "tração da mão" para salvar qualquer segmentação imperfeito. Figura 1B ilustra o algoritmo de contorno detalhado automatizado ativo. A etapa de inicialização (iteração 0) utiliza os passos básicos de processamento de imagem para gerar tamanho aproximado e localização do esferóide e gerar um contorno iniciação esférica com um tamanho estimado. O contorno iniciação alimenta o algoritmo de contorno ativo. Por sua vez ele itera para ajustar de acordo com a imagem localgradiente de forma e curvatura. O algoritmo de contorno activo termina quando o contorno estabiliza (converge), ou seja, 477 iterações para esta imagem, ou quando o número máximo pré-definido de iterações é executado. Neste exemplo, o contorno de inicialização é propositadamente ampliada para melhor mostrar o algoritmo. Na realidade, a inicialização é normalmente muito perto do limite real e muito menos iterações são necessários para o algoritmo de convergir. Posteriormente, o algoritmo leva medidas morfométricas do limite esferóide detectado. Os eixos maior e menor do esferóide são mensurados usando MATLAB toolbox de processamento de imagem (Figura 1C). O eixo principal é definido como o segmento de linha de ligação de um único par de os pontos mais distantes do contorno, o que é referido comprimento (L). O eixo menor é definida como a linha mais longa perpendicular ao eixo principal, que é a que se refere a largura (W). Neste caso, os valores de L e W são muito estreita desde oesferóide é esférica. O volume do esferóide é calculada como V = 0,5 * L * W 2. Uma das características de SpheroidSizer é a sua detecção automática do limite dos esferóides mesmo em imagens com fundo irregular ou com ruído utilizando o algoritmo de contorno ativo (Figuras 2B-D). Processamento computacional de imagens de campo luminoso é frequentemente assolada por fundo irregular, o que engana os métodos baseados em limiarização adaptativa para produzir resultados indesejados limiarização. O problema é particularmente evidente quando as placas multi-poços são utilizados e as paredes dos poços pode criar efeitos de sombreamento sobre as imagens. No entanto, porque o algoritmo de contorno activo não é sensível à mudança protecção gradual no fundo, que é capaz de identificar a segmentação do esferóide nestas imagens de campo brilhante com uma inicialização adequada. Figura 2 mostra alguns exemplos de imagens com fundo irregular ou ruidoso, como desigual iluminação (Figura 2B </strong>), os fragmentos (figura 2C) ou necrótica (Figura 2D). Com o algoritmo automatizado contorno activo, SpheroidSizer delineia esses esferóides com precisão em todas estas imagens, como mostrado no contorno vermelho no painel inferior de cada figura. O recurso de SpheroidSizer de controle de qualidade é a chave para um fluxo de trabalho de alto rendimento. O "Inicializar Manual" e ferramentas "tração da mão" são as ferramentas complementares valiosas para esta aplicação. Entre centenas ou milhares de imagens, é inevitável que o algoritmo automatizado não é capaz de detectar correctamente os esferóides em algumas imagens. Como ilustrado na Figura 3A, quando a detecção imprópria do esferóide é causada devido à etapa de inicialização, ou seja, tamanho inadequado ou localização do contorno iniciação na imagem (painel superior), a ferramenta "Inicializar Manual" funciona, permitindo que o usuário corretamente definir a localização e tamanho do spheroid manualmente (painel inferior). Ele aciona o algoritmo de contorno ativo para iniciar com o contorno definido manualmente e executar a convergir para o contorno desejado. Por essas imagens difíceis como a imagem original na Figura 3B, o esferóide está localizado em um fundo perturbador e barulhento. SpheroidSizer não é capaz de identificar corretamente o esferóide pelo método automatizado (painel superior) ou pela ferramenta "Inicializar Manual" com inicialização adequada (painel do meio). Neste caso, a ferramenta "Desenhar mão" pode ser utilizado para desenhar manualmente o contorno do esferóide, tal como ilustrado na parte inferior do painel. O programa usa o limite definido pelo usuário para medir os eixos maior e menor do esferóide e calcular o volume. Todos os resultados são imediatamente corrigidos incorporada no "Resultados da Mesa" e pode ser exportado em conformidade. Para determinar o desempenho de SpheroidSizer em conjuntos de dados maiores, primeiro comparar o tempo de operação poranalisar o mesmo conjunto de 288 imagens usando um) a medição manual com o fornecedor microscópio software fornecido; 2) SpheroidSizer com um laptop normal single-core; e 3) SpheroidSizer com um multi-core desempenho de computação paralela da estação de trabalho. As medições manuais para o nosso protocolo típico antes de desenvolver o software: o comprimento ea largura de cada esferóide são desenhados à mão e medida usando o programa de fornecedores (como visto as linhas vermelhas na parte superior do painel da Figura 4A); em seguida, as cópias do utilizador estabelece os valores das medições. SpheroidSizer processa cada imagem, gerando o limite esferóide (como mostra o contorno vermelho no painel inferior da Figura 4A), a medição da maior e menor comprimento axial, e exportar os resultados em folhas de cálculo. Como pode ser visto na Tabela 1, com base no cálculo das 288 imagens, que leva uma média de 31.67 segundos para medir um esferóide por imagem manualmente; enquanto ele só tem SpheroidSizer menos de 2 segundos e # 160; quando executado em um laptop normal single-core; e menos de 1 segundo quando rodando em um desempenho de estação de trabalho de 12 núcleos. Portanto, a análise de imagens é mais de 18x mais rápido por imagem usando SpheroidSizer de medições manuais. Ele reduz drasticamente o trabalho quando são analisados ​​mais de milhares de imagens. Em seguida, comparar a variabilidade nas medições dos 24 esferóides mostrados na Figura 4A entre as medições manuais e SpheroidSizer. Os 24 esferóides são medidos três vezes por ambos os métodos; e o desvio padrão de cada indivíduo esferóide é calculado. Como visto na Figura 4B, o desvio padrão de SpheroidSizer (linha verde e pontos) é próximo de zero, exceto para os três esferóides que são corrigidos na etapa de controle de qualidade, que ainda mostram o desvio padrão menor do que os do método de medição manual. Todos estes indicam que SpheroidSizer executa a análise de imagem de forma mais eficiente e com precisão. e_content "> Foi realizada uma tela de drogas usando esferóides BON-1 de tumores humanos em 3D para saber quais compostos em combinação com um inibidor da hsp90 são os potenciais candidatos para testar os efeitos anti-tumorais in vivo. esferóides tumorais BON-1 3D Humanos foram cultivadas em placas de 96 poços revestidas de agarose como descrito no documento anterior 15. Oito compostos diferentes com seis diluições em série mais meios e veículos foram testados para os seus efeitos individuais e combinatórias com 10 nM e 20 nM de inibidor de Hsp90 em duplicado, respectivamente. Dois esferóides foram utilizados para cada concentração do composto individual ou os compostos combinados. Foram utilizadas quatro placas de 96 poços com um total de 384 esferóides. Todos os esferóides foram fotografadas a 0, 72, 144, 168, e 192 horas. Um total de 1.920 imagens foram produzidas a partir desta experiência. Demorou SpheroidSizer apenas 30 min para completar a análise computacional dos 1.920 imagens com um 50 min adicional para o controle de qualidade e exportação de dados. SpheroidSizer acelera o processo de análise de imagem enormemente. Figura 5A mostra uma captura de tela dos arranjos pastas e nomes de arquivos para esta experiência como um exemplo para Protocolo Passo 3.3. Figuras 5B-E mostra as capturas de tela da análise de imagem janelas pop-up e resultados . usando SpheroidSizer como ilustrações para o protocolo passos 4, 5 e 7 Tomando os volumes dos esferóides 3D a partir dos resultados tabela formatada exportado de SpheroidSizer, fizemos gráficos – crescimento de esferóides tumorais 3D sobre tratamentos compostos versus tempo de tratamentos. Dois gráficos representativos desta experiência são mostrados na Figura 5F e 5G. Figura 5F mostra que os tratamentos combinados de inibidor hsp90 e cladribina (linha verde) inibem o crescimento de esferóides 3D mais do que o único tratamento de inibidor hsp90 (linha roxa) ou cladribina (linha laranja), sugerindo que os tratamentos combinados de inibidor e hsp90 cladribina pode ter ef antitumoralfects in vivo. Figura 5G mostra que os tratamentos combinados de inibidor de Hsp90 e adriamicina (linha verde) não inibe o crescimento de 3D ​​esferóides mais do que o tratamento único de adriamicina (linha laranja) ou inibidor de hsp90 (linha roxa), sugerindo que o tratamentos combinados de inibidor de Hsp90 e adriamicina não pode ter efeitos anti-tumorais in vivo. Esta experiência nos ajudou a melhor escolha dos compostos para testar os seus efeitos anti-tumorais in vivo e SpheroidSizer é a chave para a análise de dados experimentais rápida. Tabela 1. Comparação do tempo de operação em análise de imagem entre as medidas manuais e SpheroidSizer ao analisar o mesmo conjunto de 288 imagens. favor clamber aqui para ver uma versão maior desta tabela. Figura 1 SpheroidSizer -… Uma aplicação de software de código aberto para medir o tamanho do esferóide A) O fluxo de trabalho do núcleo da aplicação B) Ilustração do algoritmo de contorno ativo em diferentes estágios de iteração. Por favor, note que o contorno de inicialização (iteração 0) foi propositalmente ampliada, a fim de mostrar o algoritmo. C) As maiores e menores medidas de comprimento axial e cálculo do volume por SpheroidSizer. L – eixo maior: o segmento de linha de ligação de um único par de pontos mais distantes do contorno (referido comprimento); W – eixo menor: a linha mais longa perpendicular ao eixo maior (referida largura). <p class = "jove_content" fo: manter-together.within-page = "always"> Figura 2. Resultados representativos da segmentação automática de SpheroidSizer, demonstrando robustez contra várias condições de imagem. A) imagens de boa qualidade típica. B) imagens com diferentes brilho e contraste. C) Imagens com escombros distração. D) Imagens de esferóides com núcleo necrótico . Imagens no topo do painel de cada figura são as / imagens originais de origem; imagens no painel inferior de cada figura são as imagens de controle de qualidade; eo contorno vermelho é a segmentação esferóide desenhada por cálculo automatizado. hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51639/51639fig3.jpg "/> Figura 3. Ilustração da "Inicializar Manual" e "Hand Empate" ferramentas. A) A ferramenta "Manual Inicializar" permite que o desenho de uma forma de elipse montagem em todo o esferóide para inicialização, quando a segmentação esferóide imprecisas ocorre após a inicialização automática. B ) A ferramenta "Hand Sorteio" permite que o desenho da mão precisa do limite esferóide, quando segmentações esferóides imprecisos ocorrer com a inicialização tanto automatizado e manual. A linha azul ao redor do esferóide mostra o contorno de inicialização; o contorno vermelho é o limite esferóide identificados. Por favor, note que o esferóide em "Inicializar Manual" em A) e do esferóide em "Desenhar Hand" em B) é propositadamente ampliadas para melhor mostrar as ferramentas. <img alt="Figura 4" fo:content-width = "5 polegadas" fo: src = "/ files/ftp_upload/51639/51639fig4highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51639/51639fig4.jpg" /> Comparação de imagem desempenho análise entre SpheroidSizer e medições manuais quando se analisa o mesmo conjunto de 24 imagens Figura 4.. A) esferóides representativos para mostrar como o comprimento e largura de esferóides são determinados por medições manuais e SpheroidSizer. Top 24 imagens contêm desenhado à mão comprimento / largura de cada esferóide em linhas vermelhas usando medições manuais; menores de 24 imagens (as mesmas 24 imagens) contêm desenhado por computador limite esferóide em contorno vermelho usando SpheroidSizer. B) O desvio padrão de comprimento ou largura de três medições em cada esferóide individual. Figura 5. Um exemplo representativo da utilização de esferóideSizer em tela de drogas – análise de imagem em imagens dos esferóides que foram coletados a partir de uma tela de drogas usando esferóides tumorais BON-1 3D A) A captura de tela dos arranjos das pastas e nomes de arquivos para este projeto B) A captura de tela do avançado.. janela configurações em SpheroidSizer. C) A captura de tela da janela SpheroidSizer1.0 com resultados exibidos Table. D) A captura de tela do arquivo de saída formato exportado de SpheroidSizer. E) A captura de tela do arquivo de saída lista exportada de SpheroidSizer. F) Crescimento de esferóides tumorais em 3D sobre os tratamentos com inibidor hsp90 e cladribina G) Crescimento de esferóides tumorais em 3D sobre os tratamentos com inibidor hsp90 e adriamicina.. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. </ P>