High-throughput beeldanalyse van bolvormige tumoren: Een gebruiksvriendelijke software Toepassing op de Grootte van Sferoïden Meet automatisch en nauwkeurig

SpheroidSizer is ontworpen om geautomatiseerde detectie, afbakening en meting van de 3D-sferoïden te produceren, met een aanzienlijke vermindering van arbeid en acuut verhoogde efficiëntie voor grote hoeveelheden afbeeldingen. Figuur 1A toont de workflow van SpheroidSizer. De kern berekening stappen omvatten geautomatiseerde initialisatie, actieve contour algoritme en contour kwantificering. Na automatische berekening, de kwaliteitscontrole-functie maakt gebruik van een combinatie van "Handmatig Initialize" en "Hand Draw" instrumenten om een onvolmaakte segmentatie redden. Figuur 1B toont de gedetailleerde geautomatiseerde actieve contour algoritme. De initialisatie stap (0 iteratie) maakt gebruik van de basisfuncties voor beeldbewerking stappen om geschatte grootte en locatie van de bolvormige genereren en het genereren van een bolvormige initiatie contour met een geschatte grootte. De initiatie contour voedt in de actieve contour algoritme. Op zijn beurt herhaalt te passen aan de lokale afbeeldinghelling en kromming vorm. De actieve contour algoritme eindigt wanneer de contour stabiliseert (convergeert), namelijk 477 iteraties voor het beeld of indien het vooraf bepaalde maximale aantal iteraties uitgevoerd. In dit voorbeeld wordt de initialisatie contour opzet vergroot beter demonstreren het algoritme. In werkelijkheid, de initialisatie is meestal zeer dicht bij de werkelijke grens en veel minder herhalingen nodig zijn voor het algoritme convergeert. Vervolgens heeft de algoritme houdt morfometrische metingen van de gedetecteerde spheroïde grens. De grote en kleine assen van de bolvormige worden gemeten met behulp van MATLAB beeldverwerking toolbox (figuur 1C). De hoofdas wordt gedefinieerd als het lijnsegment verbindt een enkel paar de verste punten op de contour, die wordt aangeduid lengte (L). De kleine as is gedefinieerd als de langste lijn loodrecht op de hoofdas, die wordt aangeduid breedte (W). In dit geval, de waarden van L en W dicht aangezien desferoïde is bolvormig. Het volume van de sferoïde wordt berekend als V = 0,5 * L * W 2. Een van de kenmerken van SpheroidSizer is de geautomatiseerde detectie van de grens van de sferoïden ook op beelden met oneffen of lawaaierige achtergrond gebruikmaking van de actieve contour algoritme (Figuren 2B-D). Computationele verwerking van helder veld beelden wordt vaak geplaagd door ongelijke achtergrond, die adaptief-thresholding gebaseerde methoden misleidt om ongewenste drempeling resultaten te produceren. Het probleem is vooral duidelijk wanneer multi-well platen worden gebruikt en de wanden van de putjes kunnen schaduweffecten op de afbeeldingen. Omdat de actieve contour algoritme is niet gevoelig voor de geleidelijke verandering in schaduw achtergrond is kan sferoïde segmentatie identificeren die helderveld beelden met goede initialisatie. Figuur 2 toont een paar voorbeelden van beelden met oneffen of lawaaierige achtergrond, zoals ongelijke verlichting (Figuur 2B </strong>), puin (figuur 2C) of necrotische kern (figuur 2D). Met geautomatiseerde actieve contour algoritme SpheroidSizer schetst deze sferoïden nauwkeurig in al deze beelden zoals in de rode contour bij het onderste paneel van elke figuur. De kwaliteitscontrole kenmerk van SpheroidSizer is de sleutel tot een high-throughput workflow. De "Manual Initialize" en "Hand Draw" tools zijn de waardevolle gratis gereedschappen voor deze toepassing. Onder de honderden of duizenden afbeeldingen, is het onvermijdelijk dat de geautomatiseerde algoritme is niet in staat om de bolletjes correct te detecteren in sommige beelden. Zoals geïllustreerd in figuur 3A, wanneer onjuiste detectie van de bolvormige wordt veroorzaakt door de initialisatie stap, dwz onjuiste omvang of ligging van de inleiding contour in het beeld (bovenste paneel), de "Manual Initialize" tool werkt doordat de gebruiker goed bepalen de plaats en grootte van de spheroid handmatig (onderste paneel). Het startsein voor de actieve contour algoritme om te starten met handmatig gedefinieerde contour en uit te voeren om te convergeren naar de gewenste omtrek. Voor deze moeilijke beelden als het originele beeld in figuur 3B, is de bolvormige gelegen in een afleidende en lawaaierige achtergrond. SpheroidSizer is niet in staat om de bolvormige goed te identificeren door de geautomatiseerde methode (bovenste paneel) of door de "Manual Initialize" tool met de juiste initialisatie (middelste paneel). In dit geval kan de "Hand Draw" tool worden gebruikt om de omtrek van de bolvormige handmatig trekken, zoals weergegeven in het onderste paneel. Het programma gebruikt de gebruiker gedefinieerde grens tot de grote en kleine assen van de bolvormige meten en berekenen van het volume. Alle gecorrigeerde resultaten worden onmiddellijk opgenomen in de "Uitslagen Stand" en dienovereenkomstig kunnen worden geëxporteerd. Om de prestaties van SpheroidSizer in grotere datasets bepalen we eerst vergelijken bedrijfstijd doorhet analyseren van de dezelfde set van 288 beelden met behulp van 1) handmatige metingen met microscoop leverancier geleverde software; 2) SpheroidSizer met een single-core gewone laptop; en 3) SpheroidSizer met een multi-core parallel computing prestaties werkstation. De handmatige metingen volgen ons typisch protocol voor ontwikkeling van de programmatuur: de lengte en breedte van elke sferoïde worden getrokken met de hand en gemeten met de programmaleverancier (gezien de rode lijnen in het bovenste deel van figuur 4A); Vervolgens kopieert de gebruiker de waarden van de metingen. SpheroidSizer verwerkt elk beeld door het genereren van de bolvormige grens (zoals de rode omtrek in het onderste deel van figuur 4A), meten van de axiale grote en kleine lengte en exporteren van de resultaten in spreadsheets. Zoals blijkt uit tabel 1, gebaseerd op de berekening van 288 beelden duurt gemiddeld 31,67 sec tot een bolvormige per beeld handmatig meten; terwijl het duurt maar SpheroidSizer minder dan 2 sec & # 160; bij het rijden op een single-core gewone laptop; en minder dan 1 sec bij het rijden op een 12-core prestaties werkstation. Daarom beeldanalyse is dan 18x sneller per beeld met behulp SpheroidSizer dan handmatige metingen. Het vermindert drastisch arbeid wanneer meer dan duizend beelden worden geanalyseerd. Vervolgens vergelijken we de variabiliteit in de metingen van de 24 bolletjes in figuur 4A tussen handmatige metingen en SpheroidSizer. De 24 sferoïden worden driemaal gemeten met beide methoden; en de standaardafwijking van elke afzonderlijke sferoïde berekend. Zoals te zien in figuur 4B, de standaarddeviatie van SpheroidSizer (groene lijn en stippen) dicht bij nul, behalve voor de drie bolletjes die worden gecorrigeerd bij de kwaliteitscontrole stap, die nog steeds blijkt kleinere standaarddeviatie dan die uit de handmatige metingen methode. Al deze geven aan dat SpheroidSizer voert de beeldanalyse efficiënter en nauwkeuriger. e_content "> Wij hebben een drug scherm met behulp van menselijke BON-1 3D bolvormige tumoren uit te zoeken welke verbindingen in combinatie met een Hsp90-remmer zijn de potentiële kandidaten voor het testen van de anti-tumor effecten in vivo. Menselijke BON-1 3D bolvormige tumoren werden gekweekt on-agarose gecoate 96-well platen zoals beschreven in het vorige artikel 15. Acht verschillende verbindingen met zes seriële verdunningen plus media en trucks werden gescreend op hun single en combinatorische effecten 10 nM en 20 nM Hsp90 remmer in duplo respectievelijk. Twee sferoïden werden voor elke concentratie van de afzonderlijke verbinding of de gecombineerde verbindingen. Vier 96-well platen met totaal 384 sferoïden werden gebruikt. Alle sferoïden werden afgebeeld op 0, 72, 144, 168 en 192 uur. totaal 1920 beelden geproduceerd van dit experiment. Het duurde SpheroidSizer slechts 30 minuten naar de computationele analyse van de 1920 foto's compleet met een extra 50 min voor de kwaliteitscontrole en data-export. SpheroidSizer versnelt het beeldanalyse proces enorm. Figuur 5A toont een screenshot van de map regelingen en bestandsnamen voor dit experiment als een voorbeeld voor het protocol Stap 3.3. figuren 5B-E toont de screenshots van de beeldanalyse pop-up vensters en resultaten . gebruik SpheroidSizer als illustraties voor Protocol stap 4, 5, en 7, waarbij de volumes van de 3D sferoiden van de geformatteerde resultaten tabel geëxporteerd uit SpheroidSizer, we grafieken – groei van 3D bolvormige tumoren bij samengestelde behandelingen versus tijd van behandelingen. Twee representatieve grafieken van dit experiment worden getoond in Figuur 5F en 5G. Figuur 5F toont aan dat de gecombineerde behandelingen van Hsp90 remmer en cladribine (groene lijn) remmen de groei van 3D sferoiden meer dan de enkele behandeling van Hsp90 remmer (paarse lijn) of cladribine (oranje lijn), wat suggereert dat de gecombineerde behandelingen van Hsp90-remmer en cladribine kunnen anti-tumor ef hebbenfecten in vivo. Figuur 5G toont aan dat de gecombineerde behandelingen van Hsp90 remmer en adriamycine (groene lijn) remt de groei van 3D sferoiden meer dan de enkele behandeling van adriamycine (oranje lijn) of Hsp90 remmer (paarse lijn), wat suggereert dat de gecombineerde behandeling van Hsp90 remmer en adriamycine niet anti-tumor effecten in vivo. Dit experiment heeft ons geholpen de verbindingen beter te selecteren om hun anti-tumor effecten te testen in vivo en SpheroidSizer is de sleutel tot de snelle experimentele data-analyse. Tabel 1. Vergelijking van de bedrijfstijd op beeldanalyse tussen handmatige metingen en SpheroidSizer bij het ​​analyseren van de zelfde reeks van 288 beelden. Gelieve clik hier voor een grotere versie van deze tabel bekijken. Figuur 1 SpheroidSizer -… Een open-source software-applicatie voor het meten van de grootte van de bolvormige A) De kern workflow van de aanvraag B) Illustratie van de actieve contour algoritme in verschillende stadia van iteratie. Let op: de initialisatie contour (iteratie 0) opzet werd uitgebreid om het algoritme. C) De major en minor axiale lengte metingen en berekening van het volume door SpheroidSizer showcase. L – hoofdas: het lijnsegment verbindt een paar verste punten op de contour (bedoelde lengte); W – nevenas: de langste lijn loodrecht op de hoofdas (hierna breedte). <p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "altijd"> Figuur 2. Representatieve resultaten van de geautomatiseerde segmentatie van SpheroidSizer, tonen de robuustheid tegen verschillende voorwaarden afbeelding. A) Typische beelden van goede kwaliteit. B) afbeeldingen met verschillende helderheid en contrast. C) Afbeeldingen met afleidende puin. D) Afbeeldingen van bolletjes met necrotische kern . Beelden op het bovenpaneel van elke figuur zijn de bron / originele beelden; beelden op het onderste paneel van elke figuur zijn de kwaliteitscontrole beelden; en de rode omtrek is de bolvormige segmentatie getrokken door geautomatiseerde berekening. hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51639/51639fig3.jpg "/> Figuur 3. Illustratie van de "Manual Initialize" en "Hand Draw" gereedschap. A) De "Manual Initialize" tool maakt het mogelijk de tekening van een passende ellipsvorm over de spheroïde voor initialisatie, wanneer onjuiste spheroïde segmentatie optreedt na de automatische initialisatie. B ) De "Hand Draw" tool maakt nauwkeurige hand-tekening van de bolvormige grens, wanneer onjuiste spheroïde segmentaties optreden met zowel automatische en handmatige initialisatie. De blauwe lijn rond de bolvormige toont de initialisatie contour; de rode contour is de geïdentificeerde spheroïde grens. Let op: de bolvormige in "Manual initialiseren" in A) en de bolvormige in "Hand Draw" in B) met opzet wordt vergroot om de gereedschappen beter presenteren. <img alt="Figuur 4" fo:content-width = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/51639/51639fig4highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51639/51639fig4.jpg" /> Figuur 4. Vergelijking van beeldanalyse prestaties tussen SpheroidSizer en handmatige metingen bij het ​​analyseren van de zelfde reeks van 24 beelden. A) Representatieve sferoïden te tonen hoe de lengte en breedte van sferoïden worden bepaald door handmatige metingen en SpheroidSizer. Top 24 beelden bevatten handgetekende lengte / breedte van elke spheroïde in rode lijnen met behulp van handmatige metingen; onderste 24 beelden (dezelfde 24 foto's) bevatten computergetekende spheroïde grens in rood overzicht behulp SpheroidSizer. B) Standaardafwijking van lengte of breedte van drie metingen op elke afzonderlijke spheroïde. Figuur 5. Een representatief voorbeeld van het gebruik van SferoïdeSizer in drug scherm – beeldanalyse op beelden van de bolletjes 'die werden verzameld uit een drug scherm met behulp van BON-1 3D bolvormige tumoren A) Een screenshot van de map regelingen en bestandsnamen voor dit project B) Een screenshot van het gevorderde.. configuraties venster in SpheroidSizer. C) Een screenshot van SpheroidSizer1.0 venster met weergegeven Uitslagen Stand. D) Een screenshot van het formaat output bestand geëxporteerd uit SpheroidSizer. E) Een screenshot van de lijst output file geëxporteerd uit SpheroidSizer. F) groei van 3D bolvormige tumoren bij de behandelingen met Hsp90 remmer en cladribine. G) De groei van 3D bolvormige tumoren bij de behandelingen met Hsp90 remmer en adriamycine. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. </ P>