Hochdurchsatz-Analyse von Bild Tumorsphäroide: Eine benutzerfreundliche Software-Anwendung, um die Größe der Sphäroide automatisch und präzise messen

SpheroidSizer wurde entwickelt, um automatisierte Erkennung, Abgrenzung und Messung der 3D-Sphäroiden zu produzieren, mit bemerkenswert reduziert Arbeits-und akut erhöhte Effizienz für große Mengen von Bildern. 1A zeigt den Workflow SpheroidSizer. Die Kernrechenschritte umfassen automatisierte Initialisierung aktiven Konturalgorithmus und Kontur Quantifizierung. Nach der automatisierten Berechnung verwendet der Qualitätskontrolle Merkmal eine Kombination von "Hand initialisieren" und "Hand-Draw"-Werkzeugen, um jede unvollkommene Segmentierung zu retten. 1B zeigt die detaillierte automatisierte aktiven Konturalgorithmus. Der Initialisierungsschritt (0-ten Iteration) nutzt grundlegende Bildverarbeitungsschritte auf ungefähre Größe und Lage des Sphäroids zu erzeugen und erzeugen eine sphärische Kontur Initiierung mit einer geschätzten Größe. Die Einleitung Kontur-Feeds in den aktiven Konturalgorithmus. Im Gegenzug durchläuft sie nach den örtlichen Bildes anpassenSteigung und Krümmung Form. Der aktive Konturalgorithmus beendet ist, wenn die Kontur stabilisiert (konvergiert), dh 477 Iterationen für dieses Bild, oder wenn der vorgegebene maximale Anzahl von Iterationen ausgeführt wird. In diesem Beispiel wird die Initialisierung Kontur absichtlich vergrößert, um besser präsentieren den Algorithmus. In Wirklichkeit ist die Initialisierung der Regel sehr nahe an der tatsächlichen Grenze und viel weniger Iterationen für den Algorithmus erforderlich sind, um zu konvergieren. Anschließend nimmt der Algorithmus morphometrische Messungen der erfassten Grenze Sphäroid. Die Haupt-und Nebenachsen des Sphäroiden sind mit MATLAB Bildverarbeitungshilfsfunktionen (1C) gemessen. Die Hauptachse wird als Liniensegment, ein einzelnes Paar von den entferntesten Punkten der Kontur, die Länge (L) bezeichnet wird, definiert. Die Nebenachse ist als die längste Linie, die senkrecht zu der Hauptachse, die Breite (W) bezeichnet wird, definiert. In diesem Fall sind die Werte von L und W sehr nahe, da dieSphäroid kugelförmig ist. Das Volumen des Sphäroids als V = 0,5 * L * W 2 berechnet. Eines der Merkmale der SpheroidSizer ist die automatische Erfassung der Grenze der Sphäroide auch auf Bilder mit unebenen oder verrauschten Hintergrund unter Verwendung des aktiven Konturalgorithmus (Fig. 2B-D). Computational Verarbeitung von Hellfeld-Bildern wird oft von unebenen Hintergrund, der adaptive Schwellen-basierte Methoden verleitet, um unerwünschte Ergebnisse produzieren Schwellen geplagt. Das Problem ist besonders deutlich, wenn Multi-Well-Platten verwendet werden, und die Wände der Wells kann Schatteneffekte auf die Bilder erstellen. , Da die aktive Konturalgorithmus ist nicht empfindlich auf die schrittweise Veränderung Schattierung im Hintergrund, ist jedoch in der Lage, Sphäroid Segmentierung in diesen hellen Feldbilder mit der richtigen Initialisierung zu identifizieren. Abbildung 2 zeigt einige Beispiele von Bildern mit unebenen oder laute Hintergrund, wie uneben Beleuchtungs (2B </strOng>), Fremdkörper (Fig. 2C) oder nekrotischen Kern (Fig. 2D). Mit automatisierten aktiven Konturalgorithmus, SpheroidSizer umreißt diese Kügelchen genau in all diesen Bildern, wie in der roten Kontur an der unteren Platte jedes Bild dargestellt. Die Qualitätskontrolle Merkmal SpheroidSizer ist der Schlüssel zu einem Hochdurchsatz-Workflow. Der "Leitfaden initialisieren" und "Hand-Draw"-Tools sind die wertvollen kostenlose Tools für diese Anwendung. Unter Hunderte oder Tausende von Bildern, ist es unvermeidbar, dass die automatisierte Algorithmus nicht in der Lage, um die Kügelchen in einigen Bildern korrekt zu erfassen. Wie in 3A, wenn unsachgemäße Erfassung der Sphäroid aufgrund der Initialisierung verursacht Schritt dargestellt, dh falsche Größe oder Position von der Einleitung Kontur im Bild (oben), funktioniert das "Handbuch Initialize"-Tool, indem der Benutzer richtig beschreiben die Lage und Größe des sphermanuell oid (unteres Bild). Es löst die aktive Kontur-Algorithmus, um mit manuell definierten Kontur initiieren und durchführen, um auf die gewünschte Kontur zu konvergieren. Für diesen schwierigen Bilder wie das Originalbild in Abbildung 3B ist der Sphäroid in einem störend und laut Hintergrund befindet. SpheroidSizer ist nicht in der Lage, die Sphäroid richtig zu identifizieren durch das automatisierte Verfahren (oben) oder von der "Hand Initialize"-Werkzeug mit der richtigen Initialisierung (Mitte). In diesem Fall kann der "Hand Draw"-Tool verwendet werden, um den Umriss der Sphäroid manuell zu zeichnen, wie in dem unteren Feld veranschaulicht werden. Das Programm verwendet die Benutzer-definierte Grenze, um die Haupt-und Nebenachsen des Sphäroids messen und berechnen die Lautstärke. Alle korrigierten Ergebnisse werden sofort in die "Ergebnistabelle" eingearbeitet und kann entsprechend exportiert werden. Um die Leistung der SpheroidSizer in größeren Datenmengen zu bestimmen, haben wir zunächst Betriebszeit zu vergleichen, indemAnalysieren der gleiche Satz von 288 Bildern mit 1) manuelle Messungen mit Mikroskop Lieferanten gelieferten Software; 2) SpheroidSizer mit einem Single-Core normalen Laptop; und 3) SpheroidSizer mit einem Multi-Core-Rechenleistung parallel Workstation. Die manuellen Messungen über unser typisches Protokoll vor der Entwicklung der Software: die Länge und die Breite jedes Sphäroid werden von Hand gezeichnet und gemessen mit dem Verkäufer Programm (wie gesehen, die roten Linien in der oberen Platte der 4A); dann werden die Benutzer Kopien unten die Werte der Messungen. SpheroidSizer verarbeitet jedes Bild durch das Erzeugen der Sphäroid-Grenze (wie gezeigt, die rote Umrandung im unteren Teil von Abbildung 4A), die Messung der axialen Haupt-und Neben Länge und Export der Ergebnisse in Tabellenkalkulationen. Wie in Tabelle 1 zu sehen ist, auf der Grundlage der Berechnung aus 288 Bildern, dauert es einen Durchschnitt von 31,67 sec einem Sphäroid pro Bild manuell zu messen; während es dauert nur SpheroidSizer weniger als 2 sec & # 160; wenn es auf einem Single-Core-normalen Laptop läuft; und weniger als 1 Sekunde, wenn sie auf einem 12-Core-Performance Workstation läuft. Daher ist die Bildanalyse über 18x schneller pro Bild mit SpheroidSizer als manuelle Messungen. Es reduziert den Arbeits, wenn mehr als Tausende von Bildern analysiert. Weiter vergleichen wir die Variabilität der Messungen der 24 in Fig. 4A gezeigt Sphäroide zwischen manueller Messungen und SpheroidSizer. Die 24 Sphäroiden werden dreimal mit beiden Verfahren gemessen; und die Standardabweichung der einzelnen Sphäroid berechnet. Wie in 4B, der Standardabweichung von SpheroidSizer (grüne Linie und Punkte) gesehen wird, ist nahe Null, außer für die drei Kügelchen, die an der Kontrolle der Qualität der Schritt, der noch zeigen kleinere Standardabweichung als die aus dem manuellen Messungen Verfahren korrigiert werden. Alle diese zeigen, dass SpheroidSizer führt die Bildanalyse effizienter und genauer. e_content "> Wir führten eine Droge Bildschirm mit menschlichen BON-1 3D Tumorsphäroide um herauszufinden, welche in Kombination mit einem hsp90-Inhibitor-Verbindungen sind die möglichen Kandidaten für die Prüfung der Anti-Tumor-Wirkung in vivo. Menschen BON-1 3D Tumorsphäroide waren gewachsen auf Agarose-beschichtete 96-Well-Platten, wie im vorherigen Papier 15 beschrieben. Acht verschiedene Verbindungen mit sechs serielle Verdünnungen sowie Medien und Vehikel wurden für ihre Einzel-und Kombinationswirkungen, die mit 10 nM und 20 nM Hsp90-Inhibitor jeweils in Duplikaten untersucht. Zwei Sphäroide wurden Für jede Konzentration der einzelnen Verbindung oder die Verbindungen in Kombination verwendet. Vier 96-Well-Platten mit insgesamt 384 Sphäroide wurden verwendet. Alle Kügelchen wurden bei 0 abgebildet, 72, 144, 168 und 192 Stunden. Insgesamt 1.920 Bilder erzeugt wurden aus diesem Experiment. SpheroidSizer Es dauerte nur 30 Minuten, um die computergestützte Analyse der 1.920 Bilder mit einer zusätzlichen 50 min für die Qualitätskontrolle und Datenexport zu vervollständigen. SpheroidSizer beschleunigt die Bildanalyseprozess enorm. 5A zeigt einen Screenshot der Ordner-und Dateinamen Arrangements für dieses Experiment als Beispiel für Protokoll Schritt 3.3. 5B-E zeigt die Screenshots der Bildanalyse-Pop-up-Fenster und Ergebnisse . Verwendung SpheroidSizer als Illustrationen für das Protokoll die Schritte 4, 5 und 7 Da die Volumina der 3D-Sphäroiden aus der formatierten Ergebnistabelle aus SpheroidSizer exportiert haben wir Graphen – Wachstum von 3D Tumorsphäroide auf Verbindung Behandlungen gegenüber der Zeit von Behandlungen. Zwei repräsentative Graphen aus diesem Experiment sind in Fig. 5F und 5G gezeigt. 5F zeigt, dass die kombinierten Behandlungen von Hsp90-Inhibitor und Cladribin (grüne Linie) hemmen das Wachstum von 3D-Sphäroide mehr als die einzige Behandlung von HSP90-Inhibitor (lila Linie) oder Cladribin (orange Linie), was darauf hindeutet, dass die kombinierten Behandlungen von Hsp90-Inhibitor und Cladribin kann Anti-Tumor-ef habenDefekte in vivo. 5G zeigt, dass die kombinierte Behandlungen von Hsp90-Inhibitor und Adriamycin (grüne Linie) nicht hemmt das Wachstum von 3D-Sphäroide mehr als die Einzelbehandlung von Adriamycin (orange Linie) oder Hsp90-Inhibitor (lila Linie), was darauf hindeutet, dass die kombinierten Behandlungen von HSP90-Inhibitor und Adriamycin haben nicht anti-Tumor-Wirkung in vivo. Dieses Experiment hat uns geholfen, wählen Sie besser die Verbindungen, um ihre Anti-Tumor-Wirkung in vivo zu testen und SpheroidSizer ist der Schlüssel für die schnelle experimentelle Datenanalyse. Tabelle 1 Vergleich der Betriebszeit. Auf Bildanalyse zwischen manueller Messungen und SpheroidSizer bei der Analyse der gleichen Menge von 288 Bildern. Bitte clecken Sie hier, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen. Abbildung 1 SpheroidSizer -… Ein Open-Source-Software-Anwendung zur Messung der Größe der Sphäroid A) Der Kern-Workflow der Anwendung B) Illustration des aktiven Konturalgorithmus in verschiedenen Stadien der Iteration. Bitte beachten Sie, dass die Initialisierung Kontur (Iteration 0) absichtlich, um den Algorithmus. C) Die Haupt-und Nebenachsenlängenmessungen und Berechnung des Volumens von SpheroidSizer präsentieren vergrößert. L – Hauptachse: das Liniensegment ein einziges Paar am weitesten Punkte auf der Kontur (bezogen auf die Länge); W – Nebenachse: die längste Linie, die senkrecht zu der Hauptachse (bezogen auf die Breite). <p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse aus dem automatisierten Segmentierung SpheroidSizer, zeigt Robustheit gegen verschiedene Bildbedingungen. A) Typische Bilder von guter Qualität. B) Bilder mit unterschiedlicher Helligkeit und Kontrast. C) Bilder mit störenden Ablagerungen. D) Bilder von Sphäroiden mit nekrotischen Kern . Bilder an der Oberseite von jeder Figur sind die Quelle / Original-Bilder; Bilder an der unteren Platte jeder Figur sind die Kontrolle der Qualität der Bilder; und die rote Umrandung ist der Sphäroid-Segmentierung durch automatisierte Berechnung erstellt. hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51639/51639fig3.jpg "/> Abbildung 3. Illustration des "Manual initialisieren" und "Hand-Zeichnen"-Tools. A) Der "Leitfaden Initialize"-Tool erlaubt das Zeichnen eines Passellipsenform über die Sphäroid für die Initialisierung, wenn ungenau Sphäroid Segmentierung nach der automatischen Initialisierung auftritt. B ) Die "Hand Draw"-Tool ermöglicht eine präzise Handzeichnung des Sphäroiden Grenze, als ungenau Sphäroid Segmentierungen erfolgen sowohl mit automatisierten und manuellen Initialisierung. Die blaue Linie auf der Sphäroid zeigt die Initialisierung Kontur; die rote Umrandung ist die identifizierten Sphäroid-Grenze. Bitte beachten Sie, dass das Sphäroid in "Manuell Initialisieren" in A) und dem Sphäroid in "Hand Draw" in B) ist absichtlich vergrößert, um besser präsentieren die Werkzeuge. <img alt="Fig. 4" fo:content-width = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/51639/51639fig4highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51639/51639fig4.jpg" /> 4. Vergleich der Bildanalyse der Leistung zwischen SpheroidSizer und manuellen Messungen bei der Analyse der gleichen Menge von 24 Bildern. A) Repräsentative Sphäroiden zu zeigen, wie die Länge und Breite von Sphäroiden durch manuelle Messungen und SpheroidSizer bestimmt. Top 24 Bilder enthalten von Hand gezeichnet Länge / Breite jedes Sphäroid in roten Linien mit manuellen Messungen; unteren 24 Bilder (die gleichen 24 Bilder) enthalten Computer gezeichnet Sphäroid Grenze in roten Umriss mit SpheroidSizer. B) Standardabweichung der Länge oder Breite von drei Messungen an jedem einzelnen Sphäroid. 5. Ein repräsentatives Beispiel für die Verwendung SpheroidSizer in Droge Bildschirm – Bildanalyse auf die Bilder der Kügelchen ", die von einer Droge Bildschirm mit BON-1 3D Tumorsphäroide A) Ein Screenshot der Ordner-und Dateinamen Arrangements für dieses Projekt B) Ein Screenshot der erweiterten gesammelt wurden.. Konfigurationen Fenster in SpheroidSizer. C) Ein Screenshot von SpheroidSizer1.0 Fenster mit Ergebnistabelle angezeigt. D) Ein Screenshot von dem Format der Ausgabedatei von SpheroidSizer. E) exportiert Ein Screenshot der Liste Ausgabedatei SpheroidSizer. F exportiert) Wachstum von 3D-Tumorsphäroide auf die Behandlungen mit Hsp90-Inhibitor und Cladribin. G) Wachstum von 3D-Tumorsphäroide auf die Behandlungen mit Hsp90-Inhibitor und Adriamycin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. </ P>