Tümör sferoidlerin Yüksek throughput Görüntü Analizi: Otomatik ve Doğru küremsiler boyutunu ölçmek için kullanıcı-dostu Yazılım Uygulama

SpheroidSizer görüntüleri büyük miktarlarda derece azaltılmış emek ve akut verimlilik artışı ile, otomatik algılama, nitelendirmesini ve 3D küremsilerin ölçümü üretmek için tasarlanmıştır. Şekil 1A SpheroidSizer iş akışını gösterir. Çekirdek hesaplama adımlar otomatik başlatma aktif kontur algoritma ve kontur ölçümü bulunmaktadır. Sonra otomatik hesaplama, kalite-kontrol özelliği herhangi bir kusurlu segmentasyon kurtarmak için "Manuel başlat" ve "El Beraberlik" araçları bir arada kullanır. Şekil 1B ayrıntılı otomatik aktif kontur algoritması göstermektedir. Başlatma adımı (0 yineleme) sfero yaklaşık konumunu ve boyutunu oluşturmak ve tahmini boyutu olan bir küresel başlatma kontur oluşturmak için temel görüntü işleme adımları kullanır. Inisiyasyon kontur aktif kontur algoritması besleniyor. Buna karşılık olarak, yerel görüntünün göre ayarlamak için dolaşırdegrade ve şekli eğrilik. Kontur (yakınlaşıyor) stabilize zaman aktif kontur algoritması bitirir, yani bu görüntü, ya da zaman için 477 yineleme yineleme önceden tanımlanmış maksimum sayıda yürütülür. Bu örnekte, başlatma kontur bilerek daha iyi algoritma vitrin büyütülür. Gerçekte, başlatma genellikle gerçek sınırına çok yakın ve çok daha az sayıda iterasyon yakınsama algoritması için ihtiyaç vardır. Daha sonra, algoritma tespit küremsi sınır morfometrik ölçümler alır. Sfero majör ve minör eksenler MATLAB görüntü işleme araç kutusu (Şekil 1C) kullanılarak ölçülür. Ana eksen uzunluğu (L) olarak adlandırılır kontur, en uzak noktaları, tek bir çift bağlantı hat segmenti olarak tanımlanmaktadır. Küçük eksen genişliği (W) olarak adlandırılır ana eksenine dik olan en uzun çizgi olarak tanımlanır. Bu durumda, L ve W değerleri bu yana çok yakın olansfero küreseldir. Sfero hacmi V = 0.5 * L * W 2 olarak hesaplanır. SpheroidSizer özelliklerinden biri bile pürüzlü veya gürültülü arka plan aktif kontur algoritması (Şekil 2B-D) kullanan ile görüntülerde sferoitlerin sınırının onun otomatik algılama olduğunu. Parlak bir alan görüntülerin Hesaplamalı işleme genellikle istenmeyen eşikleme sonuçları üretmek için uyarlamalı eşik-tabanlı yöntemler aldatmaktadır düzensiz arka, rahatsızlanır. Çok iyi plakalar kullanılır ve kuyuların duvarları görüntülerde gölgeleme etkileri yaratabilir zaman sorun özellikle belirgindir. Etkin kontur algoritması arka kademeli gölgeleme değişikliğine duyarlı değildir Ancak, bu. 2. dengesiz gibi, düzensiz veya gürültülü arka plan ile görüntülerin birkaç örnek göstermektedir uygun başlatma ile bu parlak alan görüntülerde sfero segmentasyon tanımlamak mümkün değildir aydınlatma (Şekil 2B </strong>), moloz (Şekil 2C) ya da nekrotik çekirdek (Şekil 2D). Her şeklin alt panelinde kırmızı kontur gösterildiği gibi otomatik aktif kontur algoritması ile SpheroidSizer tüm bu görüntüler doğru bu sferoitleri çizer. SpheroidSizer kalite-kontrol özelliği yüksek verimli bir iş akışı anahtarıdır. "Manuel Başlatma" ve "El Beraberlik" araçlar bu uygulama için değerlidir ücretsiz araçlardır. Görüntüler yüzlerce veya binlerce arasında, otomatik algoritması doğru bazı görüntülerde sferoidlerin tespit etmek mümkün değildir kaçınılmazdır. Sferoit olması ile uygunsuz tespiti, bu başlatma aşamasından neden olduğu Şekil 3A'da, gösterildiği gibi, örneğin, uygun olmayan boyut ve görüntü (üst panel) 'de başlangıç ​​kontur yer, "Manual Initialize" araç, kullanıcı için uygun bir şekilde izin çalışır spher konumunu ve boyutunu tanımlamakmanuel (alt panel) OID. Bu el tanımlanan kontur ile başlatmak ve istenilen taslağı üzerinde yakınsama yürütmek için aktif kontur algoritması tetikler. Şekil 3B orijinal görüntü gibi bu zor görüntüler için, küremsi bir rahatsız edici ve gürültülü arka planda yer almaktadır. SpheroidSizer düzgün otomatik yöntemi (üst panel) veya uygun başlatma (orta panel) ile "Manuel başlat" aracı ile sfero tespit etmek mümkün değildir. Bu durumda, "El Çizim" araç alt panelde gösterildiği gibi el ile sferoit olması ile ortaya çıkarabilmek için kullanılabilir. Program sfero majör ve minör eksenleri ölçmek ve hacmini hesaplamak için kullanıcı-tanımlı sınır kullanır. Tüm düzeltilmiş sonuçlar hemen "Sonuçlar Tablo" dahil edilir ve buna göre ihraç edilebilir. Büyük veri setlerinde SpheroidSizer performansını belirlemek için, ilk olarak ameliyat süresini karşılaştırmakmikroskop satıcı verilen yazılımla 1) manuel ölçümler kullanılarak 288 görüntülerin aynı seti analiz; Tek çekirdekli normal dizüstü bilgisayar ile 2) SpheroidSizer; ve 3) bir çok-çekirdekli paralel işlem performansı iş istasyonu ile SpheroidSizer. Manuel ölçümler önce yazılım geliştirme bizim tipik protokolünü uygulayın: Her sfero uzunluğu ve genişliği elle çizilmiş ve satıcı programı (Şekil 4A üst paneldeki kırmızı çizgilerini görüldüğü gibi) kullanılarak ölçülür; Kullanıcı daha sonra kopya ölçümlerin değerleri aşağı. SpheroidSizer (Şekil 4A alt panelde kırmızı anahat gösterildiği gibi), küremsi sınır üreten eksenel büyük ve küçük uzunluğunun ölçülmesi ve tablolar sonuçları vererek, her bir görüntü işler. Tablo 1'de görüldüğü gibi, 288 görüntülerden hesaplamaya göre, elle görüntü başına bir sfero ölçmek için 31.67 sn ortalama alır; sadece SpheroidSizer az 2 sn & ​​alır iken # 160; tek çekirdekli normal dizüstü çalışırken; ve en az 1 sn 12-çekirdek performansı iş istasyonunda çalışırken. Bu nedenle, görüntü analizi manuel ölçümlerden daha SpheroidSizer kullanarak imajlar 18x üzerinde hızlıdır. Görüntülerin binlerce daha analiz edildiğinde o ölçüde emek azaltır. Sonra, manuel ölçü ve SpheroidSizer arasında Şekil 4A'da gösterilen 24 sferoitlerin ölçümlerinde değişkenlik karşılaştırın. 24 küremsiler iki yöntemle üç kez ölçülür; ve her bir sferoit olması ile standart sapma hesaplanır. Şekil 4B, SpheroidSizer (yeşil çizgi ve noktalar) gelen standart sapma görüldüğü gibi hala manuel ölçümler yönteminden daha küçük standart sapma göstermek kalite-kontrol adımda, düzeltilmiş üç küremsilerden haricinde sıfıra yakındır. Bütün bu SpheroidSizer daha verimli ve doğru bir görüntü analizi gerçekleştirir olduğunu göstermektedir. e_content "> in vivo anti-tümör etkilerini test etmek için potansiyel adaylardır. insan BON-1 3B tümör sferoidler yetiştirildiği bir hsp 90 inhibitörü ile kombinasyon halinde bileşimler öğrenmek için insan BON-1 3B tümör küremsilerin kullanarak ilaç eleme işlemi yaptık Daha önceki çalışmada 15 de tarif edildiği gibi agaroz kaplı 96 oyuklu plakalar üzerine. altı seri seyreltmeleri artı ortamı ve araç ile sekiz farklı bileşikler, sırasıyla 10 nM ve 20 nM, iki kopya halinde, HSP90 inhibitörü ile tek ve kombinasyon etkileri için taranmıştır. iki sferoidler idi her bileşiğe ayrı ayrı ya da birleşik bileşiklerinin her bir konsantrasyonu için de kullanılır. toplam 384 sferoidlerle dört 96 oyuklu plakalar kullanılmıştır. bütün sferoidler, 0 ° C'de 72, 144, 168, ve 192 saat görüntülendi. 1920 görüntülerin toplam üretildi Bu deneyden. Bu kalite kontrol ve veri ihracat için ek bir 50 dakika ile 1.920 görüntülerin hesaplamalı analizi tamamlamak için SpheroidSizer sadece 30 dakika sürdü. SpheroidSizer muazzam görüntü analiz sürecini hızlandırır. Şekil 5A Protokol Adım 3.3 için bir örnek olarak, bu deney için klasör düzenlemeler ve dosya ekran resmini gösterir. Rakamlar 5B-E görüntü analizi pop-up pencereleri ve sonuçların ekran görüntüleri gösterir . tedavilerin zamana karşı bileşiği, tedavi üzerine 3D tümör küremsi büyümesi – SpheroidSizer dışa biçimlendirilmiş sonuçlar tablo 3D sferoitlerin hacimleri alarak protokol safhaları 4 için resim, 5 ve 7 olarak SpheroidSizer kullanıp grafikler yaptı. Bu deneyden elde İki temsili grafik Şekil 5F ve 5G gösterilmiştir. Şekil 5F HSP90 inhibitörü ve kladribin (yeşil hat) birleşik tedaviler 3D düşündüren, HSP90 inhibitörü (mor hattı) veya kladribin (turuncu hat) bir tedaviden daha fazla küremsiler büyümesini inhibe olduğunu gösterir ve birleştirilen hsp 90 inhibitörünün tedavi ve Kladribin anti-tümör ef gerekebilirin vivo sürdürdüğünü belirtti. Şekil 5G hsp 90 inhibitörü ve adriamisine (yeşil hat) kombine tedaviler 3D büyüme düşündüren, adriamisine (turuncu hat) veya hsp 90 inhibitörü (mor çizgi) tek tedaviden daha küremsilerden inhibe etmediğini göstermektedir ki HSP90 inhibitörü ve adriamisinin kombine tedaviler, in vivo anti-tümör etkileri olabilir. Bu deney bize daha iyi in vivo anti-tümör etkileri test etmek bileşikleri seçin ve SpheroidSizer hızlı deneysel veri analizi için anahtar oldu. Tablo 1. Çalışma süresinin karşılaştırılması manuel ölçümler ve SpheroidSizer 288 görüntülerin aynı seti analiz ederken. Arasındaki görüntü analiz edin cBu tablonun daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya yalamak. Şekil 1 SpheroidSizer -… Tekrarında farklı aşamalarında aktif kontur algoritmasının spheroid boyutunu ölçmek için bir açık kaynak yazılım uygulaması A) uygulamasının çekirdek iş akışı B) İllüstrasyon. Başlatma kontur (yineleme 0) kasten algoritma. C) majör ve minör aksiyel uzunluk ölçümleri ve SpheroidSizer tarafından hacminin hesaplanması vitrin için genişletildi unutmayın. L – büyük eksen: (uzunluk olarak anılacaktır) kontur üzerindeki en uzak nokta, tek bir çift çizgi bağlantı parçası; W – küçük eksen: (genişlik da adlandırılır) ana eksenine dik en uzun hattı. <p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Nekrotik çekirdek ile sferoidlerin rahatsız edici enkaz farklı parlaklık ve kontrast ile Şekil 2. Çeşitli görüntü koşullarına karşı dayanıklılığını gösteren SpheroidSizer arasında otomatik segmentasyon, gelen Temsilcisi sonuçları. A) Tipik iyi kalitede görüntüler. B) Resimler. C) Resimler. D) Görüntüler . Her şeklin üst panelinde Görüntüler kaynak / orijinal görüntüler; her şeklin alt panelinde görüntüleri kalite-kontrol görüntüler; ve kırmızı anahat otomatik hesaplama ile çizilmiş sfero segmentasyondur. hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51639/51639fig3.jpg "/> Araçları. A) "Manual başlat" aracı başlatma sfero genelinde bir uydurma elips şeklin çizimini sağlayan "El çizin" "Manuel başlat" ve Şekil 3. İllüstrasyon, yanlış sfero segmentasyon otomatik başlatma sonra oluşur. B ) "El Çiz" aracı küremsi sınır doğru el çizim, yanlış sfero bölütlemelerle hem otomatik ve manuel başlatma meydana sağlar. Sfero etrafında mavi çizgi başlatma kontur gösterir; kırmızı anahat tespit sfero sınırıdır. A "Manuel başlat") ve B "Hand Çiz" olarak sfero) küremsi bilerek daha iyi araçlar vitrin genişlemiş olduğunu unutmayınız. <img alt="Şekil 4," fo:content-width fo = "5in:" src = "/ files/ftp_upload/51639/51639fig4highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51639/51639fig4.jpg" /> Şekil 4. 24. görüntülerin aynı seti analiz SpheroidSizer ve manuel ölçümler arasındaki görüntü analizi performans karşılaştırması. A) Örnek sferoidler küremsiler uzunluk ve genişlik ölçümleri ve manuel SpheroidSizer belirlenir göstermek için. Top 24 görüntüler manuel ölçümler kullanılarak kırmızı çizgiler her sfero elle çizilmiş uzunluk / genişlik içerirler; alt 24 görüntüleri (aynı 24 görüntüler) SpheroidSizer. B) her spheroid üç ölçümlerinden uzunluğu veya genişliği standart sapma kullanılarak kırmızı anahat bilgisayar çizilmiş sfero sınır içerir. Şekil 5,. Küremsi kullanımı temsili bir örneği,Ilaç ekranında Sizer -.. A) Bu projenin gelişmiş B) bir ekran görüntüsü için klasör düzenleme ve dosya bir ekran görüntüsü BON-1 3D tümör sferoitleri kullanarak ilaç ekran toplanmıştır küremsilerin 'görüntülerde görüntü analizi SpheroidSizer. C) konfigürasyonları penceresi görüntülenir Sonuçlar Tablo. D ile SpheroidSizer1.0 pencerenin bir ekran görüntüsü) SpheroidSizer. E) ihraç format çıkış dosyasının bir ekran görüntüsü bir ekran SpheroidSizer. F ihraç liste çıktı dosyasının atış) hsp 90 inhibitörü ve kladribin hsp 90 inhibitörü ve Adriyamisin tedaviler üzerine 3D tümör sferoidlerin. G) Büyüme ile tedavileri üzerine 3D tümör küremsiler Büyüme. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. </ P>