腫瘍球の高スループット画像解析：自動的かつ正確にスフェロイドのサイズを測定するための使いやすいソフトウェアアプリケーション

SpheroidSizer労力を大幅に低減し、大量の画像のために急性的に増加した効率で、3Dスフェロイドの自動検出、および測定描写を生成するように設計される。 図1Aは SpheroidSizerのワークフローを示している。コア計算ステップは、自動化された初期化、動的輪郭アルゴリズムと輪郭定量化が含まれています。後の計算を自動化、品質管理機能は、任意の不完全なセグメンテーションをサルベージする「手動初期化」と「ハンドドロー」ツールを組み合わせて使用しています。 図1Bは 、詳細な自動化された動的輪郭アルゴリズムを示している。初期化ステップ（0番目の反復）は回転楕円体のおおよそのサイズおよび位置を生成し、推定サイズの球状開始輪郭を生成するために、基本的な画像処理ステップを利用する。開始輪郭は動的輪郭アルゴリズムにフィードバックする。ターンでは、ローカルの画像に応じて調整して繰り返し処理勾配と曲率形状。動的輪郭アルゴリズムこのイメージの477回の繰り返しすなわち仕上げ輪郭が安定（収束）、とき、または反復の事前に定義された最大数が実行される。この例では、初期輪郭が意図的に良好なアルゴリズムを紹介するために拡大される。現実には、初期化は、通常、実際の境界に非常に近いと非常に少ない反復が収束するアルゴリズムのために必要とされる。その後、このアルゴリズムは、検出された回転楕円境界の形態学的測定を行う。回転楕円体の長軸と短軸は、MATLABの画像処理ツールボックス（ 図1C）を用いて測定している。長軸は​​、長さ（L）と呼ばれる輪郭上の最も遠い点の一対を結ぶ線分として定義される。短軸は、幅（W）と呼ばれる長軸に直交する最長の線として定義される。この場合、L及びWの値が非常に近いので、回転楕円体は、球形である。回転楕円体の体積は、V = 0.5 * L *ののW 2として算出される。 SpheroidSizerの特徴の一つは、不均一やノイズの多い背景が動的輪郭アルゴリズム（ 図2B-D）を利用することにしても画像上のスフェロイドの境界、その自動検出です。明視野画像の演算処理は、多くの場合、不必要なしきい値処理結果を生成するために適応しきい値ベースの方法を誤解不均一な背景、悩まされている。マルチウェルプレートを使用すると、ウェルの壁画像についてシャドーイング効果を作成される場合があり問題が特に顕著である。しかし、動的輪郭アルゴリズムは、バックグラウンドで徐々に濃淡変化に敏感ではないので、それは適切な初期化でこれらの明視野像でのスフェロイドのセグメンテーションを識別することができる。 図2は 、凹凸のような、不均一やノイズの多い背景の画像のいくつかの例を示しています照明（ 図2B </strオング>）、破片（ 図2C）または壊死性コア（ 図2D）。各図の下側のパネルに赤い輪郭のように自動化された動的輪郭アルゴリズムでは、SpheroidSizerは、これらすべての画像に正確にこれらのスフェロイドの輪郭を描く。 SpheroidSizerの品質制御機能は、ハイスループットワークフローの鍵である。 「手動初期化」と「ハンドドロー」ツールは、このアプリケーションのための貴重な無料のツールです。画像数百または数千の中でも、自動化されたアルゴリズムが正しく一部の画像でスフェロイドを検出することができないことは避けられない。回転楕円体の不適切な検出により画像（上のパネル）中の開始輪郭の初期段階、 すなわち不適切な大きさまたは位置に起因する、図3Aに示すように、「手動初期化」ツールは、ユーザが適切に機能することによってspherの位置とサイズを定義するOIDを手動で（下のパネル）。これは、手動で定義された輪郭を開始し、目的の輪郭に収束するために実行する動的輪郭アルゴリズムをトリガします。 図3Bの元の画像のようにこれらの厳しい画像では、回転楕円体は気が散るし、ノイズの多い背景にあります。 SpheroidSizerが適切に自動化された方法（上のパネル）または適切な初期化（中央パネル）で「マニュアル初期化」ツールで回転楕円体を識別することができません。ここで、「ハンドドロー」ツールは、下のパネルに示されるように手動で回転楕円体の輪郭を描画するために使用することができる。プログラムは、回転楕円体の長軸と短軸を測定し、体積を計算するために、ユーザー定義の境界を使用しています。すべての修正された結果は、すぐに「結果表」に組み込まれ、それに応じてエクスポートすることができます。 大きなデータセット内のSpheroidSizerの性能を決定するために、我々は最初の操作時間を比較顕微鏡ベンダーが提供するソフトウェアを使用して1）手動測定を使用して288の画像の同じセットを分析する。 2）シングルコアの正規ラップトップSpheroidSizer;そして3）マルチコア並列コンピューティング性能のワークステーションでSpheroidSizer。手動測定前にソフトウェアを開発する私たちの典型的なプロトコルは、次のとおりです。各回転楕円体の長さと幅は、手で描かれた、ベンダー·プログラム（ 図4Aのトップパネルに赤色のラインを見られるように）を使用して測定している。 [ユーザーのコピーの測定値がダウン。 SpheroidSizer（ 図4Aの下のパネルに赤い輪郭線を示したように）、回転楕円体の境界を生成し、軸メジャーとマイナーの長さを測定し、スプレッドシートに結果をエクスポートすることで、各画像を処理する。 288画像からの計算に基づいて、 表1に見られるように、手動で、画像ごとに1つのスフェロイドを測定するために31.67秒の平均をとる;それだけSpheroidSizer未満2秒＆れている間 ＃160;シングルコアの正規のラップトップ上で実行されている。未満1秒12コア·パフォーマンス·ワークステーション上で動作しているとき。したがって、画像分析、手動測定よりもSpheroidSizerを用いて画像あたり18倍を超える高速である。画像の数千を超えるが分析されるとき、それは劇的に労働を軽減します。次に、手動測定とSpheroidSizerの間、図4（a）に示す24スフェロイドの測定値の変動を比較します。 24スフェロイドは、両方の方法を3回測定され;そして個々の各スフェロイドの標準偏差が計算される。 図4Bに見られるように、SpheroidSizer（緑色の線や点）からの標準偏差は、まだ手動測定法からのものよりも小さく、標準偏差を示す品質管理手順、で補正されている3スフェロイドを除いてゼロに近い。これらはすべて、SpheroidSizerをより効率的かつ正確に画像解析を行うことを示している。 e_content ">我々は、生体内で抗腫瘍効果をテストするための潜在的な候補である。人間BON-1の3D腫瘍スフェロイドが成長させたHsp90阻害剤との組み合わせでは、化合物かを調べるために、ヒトBON-1の3D腫瘍スフェロイドを使用して薬物スクリーニングを実施しました前報15で説明したように、アガロースでコーティングされた96ウェルプレートに。6段階希釈Plusメディアと車両との8種類の化合物は、それぞれ10 nMおよび連で20 nMのHsp90阻害剤とのシングルと組み合わせ効果についてスクリーニングした。二つのスフェロイドであった合計384スフェロイドを有する4 96ウェルプレートを用いた。個々の化合物または結合化合物の各濃度について用いられる。全てスフェロイドを0、72、144、168、および192時間で撮像した。1920画像の総数を製造したこの実験から、それは品質管理とデータエクスポートのための追加の50分で1920画像のコンピュータ解析を完了するために、SpheroidSizerのみを30分かかった。SPHEROidSizerは非常に画像解析処理を高速化します。 図5（a）はプロトコルステップ3.3を例に、この実験のためのフォルダの配置とファイル名のスクリーンショットを示しています。 図5B-Eは 、画像解析のポップアップウィンドウと結果のスクリーンショットを示しています。治療の時間に対する化合物処理の際に、3D腫瘍スフェロイドの成長 – SpheroidSizerからエクスポートフォーマットされた結果テーブルから3Dスフェロイドのボリュームを取るプロトコル手順4のためのイラスト、5、および7としてSpheroidSizerを使用して、我々はグラフを作りました。この実験からの二つの代表的グラフを図5Fおよび5Gに示されている。図5Fは、Hsp90阻害剤の併用治療を示唆し、Hsp90阻害剤（パープルライン）またはクラドリビン（オレンジライン）の単一治療よりもスフェロイドHsp90阻害剤とクラドリビン（緑色の線）の併用治療は、3Dの成長を阻害することを示し、クラドリビンは、抗腫瘍エフを有していてもよい生体内で fects。 図5Gはことを示唆し、アドリアマイシン（オレンジライン）またはHsp90阻害剤（パープルライン）の単一治療よりもスフェロイドHsp90阻害剤アドリアマイシン（緑色の線）の併用治療は、3Dの成長を阻害しないことを示していHSP90阻害剤およびアドリアマイシンの併用治療は、 インビボで抗腫瘍効果を有していなくてもよい。この実験は、私たちはより良い生体内でそれらの抗腫瘍効果をテストするために化合物を選択し、SpheroidSizerがスピーディー実験データ解析の鍵となりました。 表1。手動測定とSpheroidSizer間の画像解析に関する動作時間の比較288の画像の同じセットを分析する。 してくださいCこの表の拡大版をご覧になるにはこちらをなめる。 図1 SpheroidSizer – 。反復のさまざまな段階で動的輪郭アルゴリズムの回転楕円体の大きさを測定するためのオープンソースのソフトウェア·アプリケーションA）アプリケーションの中核となるワークフローB）イラスト。初期輪郭（反復0）が意図的アルゴリズム。C）メジャーとマイナーの軸方向の長さの測定値とSpheroidSizerによる体積の計算を紹介するために、拡大されたことに注意してください。 L – 長径：（長さと呼ばれる）輪郭上の最も遠い点の単一の対を結ぶ線分; W – 短径：（幅と呼ばれる）の長軸に対して垂直な最長行。 <pキープtogether.withinページ= "常に">：FOクラス= "jove_content" 壊死性コアを用いた球状の図2。SpheroidSizerの自動化されたセグメント化の代表的な結果、様々な画像の条件に対するロバスト性を示す。A）典型的な良い品質の画像。B）画像散る残骸と異なる明るさとコントラスト。C）写真有り。D）は画像。各図の上のパネルの画像は、ソース/元の画像である。各図の下側のパネルで画像を品質管理のイメージです。と赤のアウトラインが自動化された計算によって描かれた回転楕円体のセグメンテーションである。 hres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/51639/51639fig3.jpg "/> 図3。「手動初期化」のイラストと「ハンドドロー」ツール。A）「マニュアル初期化」ツールは、不正確な回転楕円体のセグメント化は、自動初期化後に発生した場合に、初期化のために回転楕円体全体でフィットする楕円形の描画を可能にします。B ）「ハンドドロー」ツールは、回転楕円体の境界の正確な手描き、不正確な回転楕円セグメンテーションは自動と手動の両方の初期化で発生することができます。回転楕円体の周りの青い線は初期輪郭を示しています。赤い輪郭が特定さスフェロイドの境界である。 Aの「マニュアル初期化」）における回転楕円体とBの「ハンドドロー」の回転楕円体）が意図的に優れたツールを紹介するために拡大されることに注意してください。 <img alt="図4" fo:content幅FO = "5インチ"：SRC = "/ files/ftp_upload/51639/51639fig4highres.jpg" SRC = "/ files/ftp_upload/51639/51639fig4.jpg" /> 図4の画像24の同じセットを分析SpheroidSizerと手動測定値の間の画像解析性能の比較。 A）代表スフェロイドはスフェロイドの長さと幅は、手動測定とSpheroidSizerによって決定された方法を示すこと。トップ24の画像は、手動測定を使用して赤線内の各回転楕円体の手描きの長さ/幅が含まれている。下24の画像（同24画像）SpheroidSizer。B）個々の回転楕円体上の3つの測定値からの長さや幅の標準偏差を使用して赤い枠内のコンピュータ描画回転楕円境界を含んでいる。 図5。回転楕円体の利用の代表例薬物スクリーニングにおけるサイザー- BON-1の3D腫瘍スフェロイドを使用して薬物画面から収集したスフェロイド「画像上の画像分析A）は、このプロジェクトのフォルダ構成及びファイル名のスクリーンショットB）先進のスクリーンショット。 SpheroidSizer。C）表示された結果表でSpheroidSizer1.0ウィンドウのスクリーンショットで構成ウィンドウが表示されます。D）SpheroidSizerからエクスポート形式の出力ファイルのスクリーンショット。E）SpheroidSizerからエクスポートリストの出力ファイルのスクリーンショット。F） Hsp90阻害剤とクラドリビンとの治療の際に、3D腫瘍スフェロイドの成長。G）の Hsp90阻害剤アドリアマイシンによる処置の際に、3D腫瘍スフェロイドの成長。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 </ pの>