ניתוח תפוקה גבוהה תמונה של spheroids גידול: יישום תוכנה ידידותי למשתמש כדי למדוד את גודל של spheroids באופן אוטומטי ומדויק
Summary
אנו מציגים יישום תוכנת ניתוח תמונת תפוקה גבוהה כדי למדוד את גודלו של הספרואידים גידול תלת ממדים צילמו עם מיקרוסקופ שדה בהיר. יישום זה מספק דרך מהירה ויעילה כדי לבחון את ההשפעות של תרופות טיפוליות בהספרואידים, אשר מועיל לחוקרים המעוניינים להשתמש הספרואידים במסכים בסמים.
Abstract
מספר גדל והולך של יישומים של (3D) הספרואידים גידול תלת ממדים כמודל במבחנה לגילוי סמים דורש ההסתגלות שלהם לפורמטים הקרנה בקנה מידה גדולה בכל שלב של מסך בסמים, כוללים ניתוח תמונה בקנה מידה גדולה. נכון לעכשיו אין תוכנת ניתוח תמונה מוכנה לשימוש וחופשי לפגוש בפורמט גדול בקנה מידה זה. השיטות הקיימות ביותר כרוכות ציור האורך והרוחב של הספרואידים 3D צילמו, וזה תהליך מייגע וגוזל זמן באופן ידני. מחקר זה מציג יישום תפוקה גבוהה תוכנת ניתוח תמונה – SpheroidSizer, המודד את האורך הצירי הראשי ומשניות של הספרואידים גידול 3D צילמו באופן אוטומטי ובדייקנות; מחשב את עוצמת הקול של כל אליפטית גידול 3D פרט; ואז פלטו את התוצאות בשתי צורות שונות בגיליונות אלקטרוניים למניפולציות קלים בניתוח נתונים שלאחר מכן. היתרון העיקרי של תוכנה זו הוא היישום שלה חזק תמונת ניתוח שהואמותאם למספר גדול של תמונות. הוא מספק חישוב תפוקה גבוהה וזרימת עבודה בקרת האיכות. הזמן המשוער לעבד 1,000 תמונות הוא כ 15 דקות על מחשב נייד מוגדר מינימאלי, או סביב 1 דקות בתחנת עבודה של ביצועים מרובות ליבות. ממשק המשתמש הגרפי (GUI) נועד גם לבקרת איכות קלה, ומשתמשים יכולים לעקוף באופן ידני את תוצאות המחשב. השיטה העיקרית ששמשה בתוכנה זו מותאמת אלגוריתם הפעיל קווי המתאר, הידוע גם נחשים, שהוא מתאים במיוחד לתמונות עם תאורה לא אחידה ורקע רועש, כי לעתים קרובות המכות עיבוד הדמיה אוטומטית במסכי תפוקה גבוהה. "האתחול הידני" חינם וכלים "צייר יד" לספק את גמישות SpheroidSizer בהתמודדות עם סוגים שונים של הספרואידים ותמונות באיכות שונות. תוכנת ניתוח תמונת תפוקה גבוהה זה להפליא מפחיתה עבודה ומאיצה את תהליך הניתוח. יישום תוכנה זו היא בeneficial להספרואידים גידול 3D להפכה לשגרה במודל חוץ גופית למסכי סמים בתעשייה ובאקדמיה.
Introduction
הספרואידים גידול תלת ממדי (3D) הם "מצרפי סימטריה כדורית של תאים סרטניים דומים לרקמות, ללא מצע מלאכותי לקובץ מצורף תא" 1-3. הציטולוגיה והמורפולוגיה של הגידול spheroids מחקה טוב יותר in vivo ארגון רקמת גידול וmicroenvironments מאשר תאי monolayer דו ממדים (2D). הספרואידים גידול 3D הפכו למודל מעשי במבחנה להקרנות תפוקה גבוהה של תרופות טיפוליות אנטי סרטניות או לבחון את היעילות של תרופות מועמד לפני בעלי החיים in vivo או בדיקה קלינית 4. מבחינה קלינית, את היעילות של כל טיפול תרופה נגד סרטן מוערך בהתבסס על צמיחת גידול מופחתת. בדומה לכך, אליפטית נפח יכול לשמש כמדד ליעילות ללימודי תרופה לסרטן במבחנה. נפח אליפטית (V = 0.5 * אורך * רוחב 2) נקבע בהתבסס על האורך הצירי הראשי ומשניות (ידוע יותר בכינויו אורך ורוחב)של הספרואידים 6, 7. רוב החוקרים צריכים לצייר באופן ידני את האורך ורוחב על כל אליפטית, לעתים קרובות באמצעות התוכנה המוצעים על ידי חברות מיקרוסקופיה ונמכרת יחד עם מכשירי ההדמיה. טכניקה זו הופכת להיות בעייתית כאשר מסכי סמים תפוקה גבוהה מבוצעים ויותר ממאה תמונות מיוצרים. כמה מחקרים שנעשה לאחרונה דיווחו על השימוש בארגזי כלי תוכנה לניתוח פתוחים תמונת המקור כגון CellProfiler 8-10 ו11 ImageJ לפתח שגרת פילוח / פקודות מאקרו הבסיסיות שהיה כרוך בתיקון תאורה וthresholding הפשוט. אלה שגרות לעתים קרובות צריכה להיות מחדש מותאמות לקבוצות שונות של תמונות על פי תנאי תאורה והשינוי לעומת תמונה; לכן, חבילות תוכנה אלה לא יכולים לענות על דרישת חוסנו של ניתוח תמונת תפוקה גבוהה. פרידריך ומשתפי פעולה (2009) השתמשו בתוכנת קניינית למדוד למחצה מכוניו הנפח של אליפטיתatically 5. השיטה המתוארת בMonazzam ונייר 'עמיתיו 10 הייתה שיטה חצי אוטומטי למדידת הגודל של אליפטית רק למספר קטן של תמונות. משום כך, קיים צורך ברור בכלים חזקים, גמישים, אוטומטיים וניתוח תמונה מוכן לשימוש להספרואידים גידול 3D.
במחקר זה, אנו מתארים SpheroidSizer – יישום תוכנה בקוד פתוח המבוסס על MATLAB ולמדוד את הגודל של הספרואידים גידול באופן אוטומטי ובאופן מדויק. SpheroidSizer נועד לעבד קבוצות רבות ושונות של תמונות של הספרואידים 3D באותה הפגישה. ניצול אלגוריתם מתאר הפעיל 12-14, SpheroidSizer יכול לסבול שינוי לעומת תמונה, וחסונה להתעלם שינוי הדרגתי בתאורת רקע ולהכיר הספרואידים בתמונה. זה גם יכול לסבול הרבה חפצים רגילים, למשל, פסולת, שמקורה בדגימה. זרימת העבודה מתוכננת כך שמשתמשים יכול לבצע contro איכותליטר במהלך או לאחר החישוב. דריסה ידנית של תוצאת הניתוח בקלות יכולה להתבצע במקום. מנצל את ארגז הכלים של המחשוב המקביל, מהירות הניתוח יכולה להיות שיפרה עוד יותר על ידי תיאום ליבות מחשוב מרובות לעבוד על החישוב בו זמנית על המחשב של משתמש. יתר על כן, SpheroidSizer פלטי התוצאות בשתי צורות שונות כדי לאפשר התממשקות קלה עם כלי ניתוח במורד הזרם.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר זה מציג תכנית מהירה, גמישה, יעילה ואוטומטית – SpheroidSizer לקביעה מדויקת של הגודל של הספרואידים גידול 3D. SpheroidSizer הוא קל לשימוש ודורש קלט משתמש מינימאלי. השלבים הקריטיים ביותר לריצה מדויקת, חלק והמוצלח של SpheroidSizer כוללים: שהספרואידים הם צילמו במרכז השדה בלי לגעת בקצה של באר; כל הקבצים שנתחו יחד כפרויקט אחד צריכים להיות צילמו באותם מיקרוסקופ עם אותה המטרה; כל הקבצים להיות מנותחים נקראים בצורה נכונה ומסודר כפי שמצוינים בפרוטוקול; והגדרות המוגדר על ידי משתמש נכונים הם נכנסו לפני החישוב.
היתרונות של SpheroidSizer כוללים את יכולתו לסבול את שינוי רקע הדרגתי בתמונה, כמו גם ליצירת קווי המתאר חלק שמתאימות לצורות כדוריות הכלליות של הספרואידים ניצול אלגוריתם מתאר הפעיל. ביצועים של פעילגובה יכול להיות בסכנה בשני מצבים: אתחול עני, או נוכחות של קצוות מקומיים אחרים להסיח מהגובה הרצוי. במיוחד במקרים שנבדקו, המצב השני לפעמים קורה כאשר ליבת נמקים של אליפטית גדול מושך אליו את קווי המתאר הפעילים וכתוצאה מכך גובה קטן יותר שדווח. ראוי לציין כי שיטות המבוסס על סף אוטומטי אחרות סובלות גם במצב זה, אלא אם כן לסף מוגדר באופן ספציפי ביד. התוכנה לכן מעבירה קדימה מאמץ כדי לסייע למשתמשים לזהות ולתקן פילוח נפרץ על ידי אספקת תכונות בקרת איכות קלה. אם שגיאת פילוח קורה מאתחול עני, שימושים יכולים להשתמש בכלי "ידני אתחול" כדי לעקוף את האתחול האוטומטי. כאשר איכות תמונה ירודה מדי לקווי מתאר פעילים, משתמשים יכולים בקלות "יד צייר" את קווי המתאר שמזין לכימות. תוכנה הקיימת כגון CellProfiler יכולה להיות מותאמת ליישום זה בfashio חצי אוטומטי-n. זרימת העבודה יכולה להיות מסורבלת, כאשר כמויות גדולות של תמונות בתנאי הדמיה שונות מוצגות או כאשר קבוצת משנה של תמונות צריכה התערבות אנושית יותר למדוד בצורה נכונה. SpheroidSizer מספק חבילת All-in-One עבור חישוב ובקרת איכות לניהול זרימת עבודה ניתוח תמונת תפוקה גבוהה.
SpheroidSizer כיום מוגבל לאיתור אליפטית אחת לכל תמונה ורק מודד את האורך הצירי של אליפטית. ניתן להרחיב את התכנית לתמיכה בכימות נוסף לפי צורך על ידי חוקרים כגון כימות על הספרואידים עם ליבת נמקים, גילוי הספרואידים מרובים בתמונה אחת או ניטור צורת הספרואידים. יתר על כן, ניתן לשנות את התכנית כדי לזהות ולמדוד את הגודל של הגידולים נכרת מבעלי חיים או בני אדם, אשר בהחלט יהיו מועילה לחוקרים בעת ביצוע in vivo טרום קליני או מחקר קליני. לאחר עיבוד של הספרואידים זוהו גם יכול להיחקר מטרהing בהפחתת מאמץ אנושי הנדרש לבקרת איכות ועוד שיפור תפוקה. SpheroidSizer הוא יישום ניתוח תמונה כללי להספרואידים גידול 3D, המיוצרים מכל סוגי תאים, ולכן ניתן להשתמש בו על ידי קהילת חקר הסרטן רחבה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לקרן ריימונד ובברלי סאקלר על תמיכתם במחקר שלנו.
Materials
| Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | microscope for imaging | |
| Vostro 1720 | Dell Inc. | single-core regular laptop | |
| HP Z820 | HP Inc. | multi-core performance workstation | |
| Matlab and Simulink R2013a | Mathworks, Inc, Natick, MA | Matlab software |
References
- Hamilton, G. Multicellular spheroids as an in vitro tumor model. Cancer Lett. 131, 29-34 (1998).
- Sutherland, R. M., McCredie, J. A., Inch, W. R. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. J Natl Cancer Inst. 46, 113-120 (1971).
- Inch, W. R., McCredie, J. A., Sutherland, R. M. Growth of nodular carcinomas in rodents compared with multi-cell spheroids in tissue culture. Growth. 34, 271-282 (1970).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat Protoc. 4, 309-324 (2009).
- Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids. Cancer Res. 37, 3639-3643 (1977).
- Ayers, G. D., et al. Volume of preclinical xenograft tumors is more accurately assessed by ultrasound imaging than manual caliper measurements. J Ultrasound Med. 29, 891-901 (2010).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).
- Monazzam, A., et al. A new, fast and semi-automated size determination method (SASDM) for studying multicellular tumor spheroids. Cancer Cell Int. 5, 32 (2005).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Chan, V. L. Active contours without edges. IEEE Trans Image Process. 10, 266-277 (2001).
- Bernard, O., Friboulet, D., Thevenaz, P., Unser, M. Variational B-spline level-set: a linear filtering approach for fast deformable model evolution. IEEE Trans Image Process. 18, 1179-1191 (2009).
- Kass, M. W. A., Terzopoulos, D. Snakes: Active contour models. International Journal of Computer Vision. 1, 321-331 (1987).
- Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. J Vis Exp. (66), (2012).
