De alto rendimiento de imagen Análisis de esferoides tumorales: una aplicación de software fácil de usar para medir el tamaño de esferoides forma automática y precisa

SpheroidSizer está diseñado para producir detección automatizada, delineación y medición de los esferoides 3D, con notablemente reducido de trabajo y el aumento de forma aguda eficiencia para grandes cantidades de imágenes. Figura 1A muestra el flujo de trabajo de SpheroidSizer. Los pasos de computación principales incluyen la inicialización automatizado, algoritmo de contorno activo y el contorno de la cuantificación. Después de cómputo automatizado, la función de control de calidad utiliza una combinación de "Initialize Manual" y "herramientas de drenaje de la mano" para salvar cualquier segmentación imperfecta. Figura 1B ilustra con detalle el sistema contorno activo automatizado. El paso de inicialización (iteración 0) utiliza pasos básicos de procesamiento de imágenes para generar tamaño aproximado y la ubicación del esferoide y generar un contorno de iniciación esférica con un tamaño estimado. El contorno de iniciación se introduce en el algoritmo de contorno activo. A su vez itera para ajustar de acuerdo a la imagen localpendiente y curvatura forma. El algoritmo de contorno activo termina cuando el contorno se estabilice (converge), es decir, 477 iteraciones para esta imagen, o cuando se ejecuta el número máximo predefinido de iteraciones. En este ejemplo, el contorno de inicialización se amplía a propósito de mostrar mejor el algoritmo. En realidad, la inicialización es por lo general muy cerca del límite real y se necesitan muchos menos iteraciones para el algoritmo a converger. Posteriormente, el algoritmo toma mediciones morfométricas de la frontera esferoide detectado. Los ejes mayor y menor de la esferoide se miden usando MATLAB caja de herramientas de procesamiento de imágenes (Figura 1C). El eje mayor se define como el segmento de línea que conecta un solo par de los puntos más lejanos en el contorno, que se refiere a la longitud (L). El eje menor se define como la línea más larga perpendicular al eje principal, que se refiere a la anchura (W). En este caso, los valores de L y W son muy cerca ya que elesferoide es esférica. El volumen del esferoide se calcula como V = 0,5 * L * W 2. Una de las características de SpheroidSizer es su detección automatizada de la frontera de los esferoides incluso en imágenes con el fondo desigual o ruidoso utilizando el algoritmo de contorno activo (Figuras 2B-D). Procesamiento computacional de imágenes de campo claro es a menudo plagada de fondo desigual, lo que induce a error a los métodos basados ​​en umbralización adaptativa para producir resultados no deseados de umbrales. El problema es especialmente evidente cuando se utilizan placas de múltiples pocillos y paredes de los pozos pueden crear efectos de sombra en las imágenes. Sin embargo, debido a que el algoritmo de contorno activo no es sensible a los cambios de sombreado gradual en el fondo, es capaz de identificar la segmentación del esferoide en estas imágenes de campo claro con inicialización adecuada. Figura 2 muestra algunos ejemplos de imágenes con el fondo irregular o ruidoso, como desigual iluminación (Figura 2B </strong>), residuos (Figura 2C) o núcleo necrótico (Figura 2D). Con algoritmo de contorno activo automatizado, SpheroidSizer delinea estos esferoides con precisión en todas estas imágenes como se muestra en el contorno rojo en el panel inferior de cada figura. La función de control de calidad de SpheroidSizer es clave para un flujo de trabajo de alto rendimiento. El "Initialize Manual" y herramientas "Dibujar a mano" son las herramientas gratuitos valiosos para esta aplicación. Entre cientos o miles de imágenes, es inevitable que el algoritmo automático no es capaz de detectar correctamente los esferoides en algunas imágenes. Como se ilustra en la Figura 3A, cuando la detección incorrecta del esferoide es causada debido a la etapa de inicialización, es decir, el tamaño o la ubicación del contorno de la iniciación en la imagen (panel superior) el manejo inadecuado, la herramienta "Manual Initialize" funciona al permitir que el usuario correctamente definir la ubicación y el tamaño de la spherOID manualmente (panel inferior). Se dispara el algoritmo de contorno activo para iniciar con contorno definido manualmente y ejecutar a converger en el contorno deseado. Por estas imágenes difíciles como la imagen original en la Figura 3B, el esferoide se encuentra en un fondo de distracción y ruidoso. SpheroidSizer no es capaz de identificar correctamente el esferoide por el método automatizado (panel superior) o mediante la función "Manual Initialize" con una inicialización adecuada (panel central). En este caso, la herramienta "Draw Hand" se puede utilizar para dibujar manualmente el contorno del esferoide tal como se muestra en el panel inferior. El programa utiliza el límite definido por el usuario para medir los ejes mayor y menor de la esferoide y calcular el volumen. Todos los resultados corregidos se incorporan inmediatamente en la "Tabla de Resultados" y pueden ser exportados en consecuencia. Para determinar el rendimiento de SpheroidSizer en grandes conjuntos de datos, primero comparamos el tiempo de operación poranalizar el mismo conjunto de 288 imágenes mediante 1) la medición manual con el proveedor microscopio software suministrado; 2) SpheroidSizer con una computadora portátil regular de un solo núcleo; y 3) SpheroidSizer con una estación de trabajo de rendimiento de cómputo paralelo multi-core. Las mediciones manuales siguen nuestro protocolo típico antes de desarrollar el software: la longitud y la anchura de cada esferoide se dibujan a mano y se midieron utilizando el programa de proveedor (como se ve de las líneas rojas en el panel superior de la Figura 4A); a continuación, el usuario copia hacia abajo los valores de las mediciones. SpheroidSizer procesa cada imagen mediante la generación de la frontera esferoide (como se muestra el contorno rojo en el panel inferior de la Figura 4A), la medición de la longitud axial mayor y menor, y la exportación de los resultados en hojas de cálculo. Como se ve en la Tabla 1, basado en el cálculo a partir de 288 imágenes, se necesita un promedio de 31,67 seg para medir un esferoide por imagen manualmente; mientras que sólo se necesita SpheroidSizer menos de 2 segundos y # 160; cuando se ejecuta en un ordenador portátil normal de un solo núcleo; y menos de 1 segundo cuando se ejecuta en una estación de trabajo de rendimiento de 12 núcleos. Por lo tanto, el análisis de la imagen es de más de 18x más rápido por imagen usando SpheroidSizer que las mediciones manuales. Reduce drásticamente la mano de obra cuando más de miles de imágenes son analizadas. A continuación, se compara la variabilidad en las mediciones de las 24 esferoides mostradas en la figura 4A entre las mediciones manuales y SpheroidSizer. Los 24 esferoides se miden tres veces por ambos métodos; y la desviación estándar de cada esferoide individuo se calcula. Como se ve en la figura 4B, la desviación estándar de SpheroidSizer (línea verde y los puntos) es cercano a cero, excepto para los tres esferoides que se corrigen en el paso de control de calidad, que todavía muestran la desviación estándar más pequeñas que las del método de medición manual. Todo esto indica que SpheroidSizer realiza el análisis de imagen más eficiente y precisa. e_content "> Se realizó una prueba de drogas utilizando esferoides BON-1 3D de tumores humanos para averiguar qué compuestos en combinación con un inhibidor de hsp90 son los candidatos potenciales para probar los efectos antitumorales in vivo. esferoides tumorales BON-1 3D Humanos fueron cultivadas en placas de 96 pocillos recubiertos de agarosa como se describe en el documento anterior 15. Ocho compuestos diferentes con seis diluciones en serie además de medios de comunicación y vehículo fueron seleccionados por sus efectos individuales y combinatorias con 10 nM y 20 nM de inhibidor de la HSP90 en los duplicados, respectivamente. Dos esferoides fueron utilizado para cada concentración del compuesto individual o los compuestos combinados se utilizan. Cuatro placas de 96 pocillos con un total de 384 esferoides. Todos los esferoides fueron imágenes a 0, 72, 144, 168, y 192 h. Se produjeron un total de 1.920 imágenes a partir de este experimento. Se tomó SpheroidSizer sólo 30 minutos para completar el análisis computacional de las imágenes 1920 con un 50 min adicionales para el control de calidad y la exportación de datos. esferoidSizer acelera el proceso de análisis de imágenes enormemente. Figura 5A muestra una captura de pantalla de los arreglos de carpetas y nombres de archivo para este experimento como un ejemplo para el protocolo de la Etapa 3.3. Figuras 5B-E muestra las capturas de pantalla de los análisis de imágenes ventanas pop-up y resultados . utilizando SpheroidSizer como ilustraciones para el protocolo de los pasos 4, 5 y 7 Tomando los volúmenes de los esferoides 3D a partir de la tabla de resultados con formato exportado de SpheroidSizer, hicimos gráficas – crecimiento de esferoides tumorales 3D sobre tratamientos compuestos en función del tiempo de los tratamientos. Dos gráficos representativos de este experimento se muestran en la Figura 5F y 5G. Figura 5F muestra que los tratamientos combinados de inhibidor de hsp90 y cladribina (línea verde) inhiben el crecimiento de esferoides 3D más que el tratamiento único de inhibidor de hsp90 (línea morada) o cladribina (línea naranja), lo que sugiere que los tratamientos combinados de inhibidor de hsp90 y cladribina puede tener ef antitumoraldefectos en vivo. Figura 5G muestra que los tratamientos combinados de inhibidor de hsp90 y adriamicina (línea verde) no inhibe el crecimiento de esferoides 3D más que el tratamiento único de adriamicina (línea naranja) o un inhibidor de hsp90 (línea morada), lo que sugiere que la tratamientos combinados de inhibidor de hsp90 y adriamicina pueden no tener efectos antitumorales in vivo. Este experimento nos ayudó a seleccionar mejor los compuestos para probar sus efectos antitumorales in vivo e SpheroidSizer es la clave para el análisis de datos experimentales rápida. Tabla 1 Comparación del tiempo de operación. Sobre análisis de imágenes entre las mediciones manuales y SpheroidSizer la hora de analizar el mismo conjunto de 288 imágenes. Por favor, clamer aquí para ver una versión más grande de esta tabla. Figura 1 SpheroidSizer -… Una aplicación de software de código abierto para medir el tamaño del esferoide A) El flujo de trabajo básico de la aplicación B) Ilustración del algoritmo de contorno activo en diferentes etapas de iteración. Tenga en cuenta que el contorno de inicialización (iteración 0) se amplió a propósito con el fin de mostrar el algoritmo. C) Los mayores y menores medidas de longitud axial y el cálculo del volumen de SpheroidSizer. L – eje mayor: el segmento de línea que conecta un solo par de puntos más lejanos en el contorno (que se refiere a la longitud); W – eje menor: la línea más larga perpendicular al eje principal (que se refiere a la anchura). <p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figura 2. Los resultados representativos de la segmentación automatizada de SpheroidSizer, mostrando robustez frente a las diversas condiciones de imagen. A) imágenes de buena calidad típica. B) Las imágenes con distinto nivel de brillo y contraste. C) Las imágenes con los restos de distracción. D) Imágenes de esferoides con núcleo necrótico . Imágenes en el panel superior de cada figura son la fuente / imágenes originales; imágenes en el panel inferior de cada figura son las imágenes de control de calidad; y la línea roja es la segmentación del esferoide dibujado por el cómputo automatizado. hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51639/51639fig3.jpg "/> Figura 3. Ejemplo de la "Initialize Manual" y "Hand Draw" de herramientas. A) La función "Manual Initialize" permite que el dibujo de una forma de elipse de ajuste a través del esferoide para la inicialización, cuando la segmentación esferoide inexacta se produce después de la inicialización automática. B ) La herramienta "Mano Draw" permite gráfico de la mano precisa del límite del esferoide, cuando segmentaciones esferoide inexactas ocurren con inicialización tanto automatizado y manual. La línea azul alrededor del esferoide muestra el contorno de inicialización; la línea roja es el límite esferoide identificado. Tenga en cuenta que el esferoide en "Initialize Manual" en A) y el esferoide en "Draw Hand" en B) se amplía a propósito de mostrar mejor las herramientas. <img alt="Figura 4" fo:content-width = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/51639/51639fig4highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51639/51639fig4.jpg" /> Figura 4. Comparación del rendimiento de análisis de imagen entre SpheroidSizer y mediciones manuales en el análisis de la misma serie de 24 imágenes. A) esferoides representativos para mostrar cómo la longitud y la anchura de esferoides se determinan por mediciones manuales y SpheroidSizer. 24 Top imágenes contienen dibujado a mano longitud / anchura de cada esferoide en líneas rojas utilizando mediciones manuales; 24 imágenes más bajas (las mismas 24 imágenes) contienen límite esferoide ordenador dibujada en el esquema rojo usando SpheroidSizer. B) Desviación estándar de longitud o anchura a partir de tres mediciones en cada esferoide individual. Figura 5. Un ejemplo representativo de la utilización de EsferoideSizer en detección de drogas – el análisis de imágenes en imágenes los esferoides 'que se recogieron a partir de un examen de drogas utilizando esferoides tumorales BON-1 3D A) Una captura de pantalla de los arreglos de carpetas y nombres de archivo para este proyecto B) Una captura de pantalla de la avanzada.. ventana de configuraciones en SpheroidSizer. C) Una captura de pantalla de la ventana que aparece con SpheroidSizer1.0 Resultados En la tabla. D) Una captura de pantalla del archivo de salida en formato exportado de SpheroidSizer. E) Una captura de pantalla del archivo de salida lista exportada desde SpheroidSizer. F) El crecimiento de esferoides tumorales 3D sobre los tratamientos con inhibidores hsp90 y cladribina. G) ​​El crecimiento de esferoides tumorales 3D sobre los tratamientos con inhibidores hsp90 y adriamicina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. </ P>